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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 为什么单酶切切不开
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070250035

银虫 (小有名气)

[求助] 为什么单酶切切不开

最近最转基因用的Super1300载体，选HindIII和Spe1 酶双酶切后和目的片段连接，但是总是空载，自连，没办法，单酶切验证发现Spe1酶切不开，HindIII没问题，可以确定不是酶的问题，因为用别人切其他质粒没问题的Spe1酶切的，但是切我的空载都不行，另外想着换 酶切位点，拿其他酶试了一下，也能切开，但是SpeI就是切不开，和空载的条带一样！一直弄不明白怎么回事，我用的NEB酶，看NEB目录说这个酶对甲基化并不敏感啊，怎么回事啊？？？谁能救救我！
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探究知识的海洋
1楼2013-04-10 10:51:50
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 070250035 at 2013-04-11 09:42:08
40微升体系加了5微升质粒，酶加1.5微升，切不开啊，我用试剂盒提的质粒，应该没问题吧？？？是Spe1酶有什么特殊的么？？...

确定质粒序列没有问题吗？会不会是突变了。
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6楼2013-04-11 13:17:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+3, 鼓励应助！ 2013-04-11 17:21:33
有些酶对盐浓度比较敏感。一般提的质粒里可能会有一定盐分。你用的多少μl的酶切体系，质粒加了多少？一般可以扩大酶切体系的体积可以解决问题。
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2楼2013-04-10 14:53:16
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tayifeita

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
载体上面那个位点是不是被甲基化了？或者是缓冲液有问题？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2013-04-10 20:07:18
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070250035

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-10 14:53:16
有些酶对盐浓度比较敏感。一般提的质粒里可能会有一定盐分。你用的多少μl的酶切体系，质粒加了多少？一般可以扩大酶切体系的体积可以解决问题。

40微升体系加了5微升质粒，酶加1.5微升，切不开啊，我用试剂盒提的质粒，应该没问题吧？？？是Spe1酶有什么特殊的么？？
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探究知识的海洋
4楼2013-04-11 09:42:08
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