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hubohuna

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切，切不下来

小弟第一次够载体，片段大小大约一千三，酶切位点为hind111&noc1（没有设置保护碱基），之前切t载体，切载体，切片段都是成功的，然后将目的片段和载体连接导入大肠杆菌后，涂板子，挑菌落，做菌落pcr，显示有带，做质粒pcr验证显示也有目的带（可不可以说，片段是连到质粒上去了的？）但是酶切没结果，单酶切和双酶切条带基本一样。这个问题困扰我近半个月了，反反复复做了好几次都一样。
ps.质粒是用安比奥的试剂盒提的。
求大神帮忙指点，感激不尽！

[ Last edited by 1949stone on 2012-6-9 at 13:02 ]
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1楼2012-06-08 18:41:10
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回帖置顶 ( 共有1个 )

jimjohntall

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 回帖置顶 2012-06-08 21:50:58
1949stone: 金币+1, 鼓励 2012-06-08 21:51:06
有没有作对照，提取质粒做酶切双切如果得不到目的片段，你可以试试单酶切，看一下大小的。你选的酶，酶切位点在目的片段中有没有，是不是唯一的。
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4楼2012-06-08 19:32:24
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普通回帖

hubohuna

新虫 (初入文坛)
质粒大概5kbp的样子
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2楼2012-06-08 18:44:58
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swky

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
3楼2012-06-08 18:51:59
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hubohuna

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jimjohntall at 2012-06-08 19:32:24
有没有作对照，提取质粒做酶切双切如果得不到目的片段，你可以试试单酶切，看一下大小的。你选的酶，酶切位点在目的片段中有没有，是不是唯一的。

有做对照，双酶切和单酶切条带是一样的，片段上是没有酶切位点的，其实我想知道我的这个结果是不是可以说片段是连到载体上去了，只是酶切没切下来，毕竟菌落和质粒pcr都有目的条带。
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5楼2012-06-09 08:45:17
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viki_MDK

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 鼓励 2012-06-09 13:03:21
不能确定是否已经连上。PCR试剂可能污染了你的目的片段，所以怎么P都会有条带的，送去测序是最简单的了。
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6楼2012-06-09 09:37:02
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l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果你确定连上了，换换酶试试？有可能酶失活。另外，用试剂盒提质粒，最后不要用TE把质粒洗下来，用水。
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相信自己
7楼2012-06-09 10:07:44
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jimjohntall

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by hubohuna at 2012-06-09 08:45:17
有做对照，双酶切和单酶切条带是一样的，片段上是没有酶切位点的，其实我想知道我的这个结果是不是可以说片段是连到载体上去了，只是酶切没切下来，毕竟菌落和质粒pcr都有目的条带。...

嗯用质粒做PCR如果能P出目的条带来，是可以认为连上去的。你觉得不可靠的话可以测一下序列就可以了
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8楼2012-06-09 12:29:30
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jqq1985

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-06-13 13:39:37
又看到很多做PCR验证的。基本上PCR验证假阳性很多，我有个师姐用空载质粒做PCR验证都可以P出大小与阳性一致的条带。所以PCR验证是下下策。能酶切验证的尽量酶切验证。另外看你开始的描述，没有带保护碱基的片段很多酶都切不开的。自然后面也连不进去，所以，你长出的单菌落很有可能是只切了一刀的载体自连了。
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9楼2012-06-10 14:34:34
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wcwluwei

禁虫 (小有名气)
★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-13 13:39:59
本帖内容被屏蔽
10楼2012-06-10 16:02:57
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