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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切，切不下来
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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nemo88

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-06-11 13:56:03
本帖内容被屏蔽
11楼2012-06-11 08:02:30
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蜗牛061610

木虫 (小有名气)

1

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-06-11 13:56:14
个人认为酶切验证比较靠谱，我用一个质粒连接1kb的产物，空质粒照样能批出1kb条带，所以有时候pcr验证不很靠谱。估计楼主是没有连接上，长出的克隆或许是因为双切不充分，造成单切自连的（两个酶切位点挨的太紧的话，双酶切不好切，你大致看看两个切点的距离）。
最好还是你双切能验证出片段。
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1
12楼2012-06-11 09:27:18
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cuihao102

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以重提下质粒试试！！我以前就遇到过这种情况，重提了一次就切开了
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13楼2012-06-11 10:34:31
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hubohuna

新虫 (初入文坛)
衷心感谢各位同仁，我打算先送测序，没结果的话就重新定引物了，再次感谢各位！
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14楼2012-06-11 10:46:27
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geneyhh

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-06-13 13:40:33
你做菌液PCR时用的什么引物？两个引物最好都是载体上的引物，然后根据PCR片段大小进行判断，不要选择insert DNA上的引物，当然一个是insert DNA 上的引物，一个是vector上的引物也是没问题的。insert DNA和vector连上以后酶切位点可能会消失，所以切不下来，及时是sticky end也可能会消失哦。送出去测序可以比较快的得出结论。
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15楼2012-06-11 16:15:40
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apollo/ty

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励下 2012-06-13 13:40:48
要有一定的纯度才能保证你PCR出来的是你的片段，而且跑胶后就要确认你的质粒大小是否为你片段和载体连接后的大小，鉴定最好用酶切法，PCR不是很准
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16楼2012-06-12 22:27:31
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小娇amazing

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

估计是 连接上之后酶切位点发生了变化，所以才会切不下来 你分别单切试试，看能不能切开，看重组质粒片段的大小
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17楼2012-06-13 15:55:49
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lihao1988903

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

如果你确定连上了，换换酶试试？有可能酶失活。另外，用试剂盒提质粒，最后不要用TE把质粒洗下来，用水。
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18楼2012-06-13 16:20:17
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colaes

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
18楼: Originally posted by lihao1988903 at 2012-06-13 16:20:17
如果你确定连上了，换换酶试试？有可能酶失活。另外，用试剂盒提质粒，最后不要用TE把质粒洗下来，用水。

为什么 用水洗更好呢？求指导
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19楼2013-03-06 16:37:56
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我好暴躁啊

新虫 (小有名气)
我也是这种情况呀
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20楼2017-05-31 09:52:49
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