24小时热门版块排行榜    

查看: 4376  |  回复: 14
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

牧歌ping

铜虫 (小有名气)

[求助] Xho1和EcoR1双酶切,切不开

我的目的片段是400bp左右,两端引入Xho1和EcoR1酶切位点,它们有共用的H buffer,双酶切怎么都切不开,单个酶切却都能切开;分别先一个酶切后乙醇沉淀,再另一个酶切,仍然切不开,很郁闷!
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-06 17:27:33
牧歌ping: 金币+7, ★★★很有帮助 2012-11-07 09:27:50
引用回帖:
5楼: Originally posted by 牧歌ping at 2012-11-06 15:15:57
两个酶的buffer都是H buffer,是它们活性最高的buffer。我每次至少做2管平行,一般酶切2~3h,最长切过夜了,可还是没有完全切开,感觉两个酶加一起有一个失活一样。如果不用醇沉,第二个酶切这个体系怎么弄啊?谢谢 ...

第二个酶切的体系和平时的酶切体系是一样的(如第一个)
没事的。就是第一次酶切的时候多切两管,回收的时候都加到一个柱子上,用25微升洗脱,这样第一次酶切后的浓度可以保证,把回收的都酶切了,再跑胶回收到一个柱子了
这样就可以了
试试
我都是这样做的
但是第一次不跑胶直接回收,但是第二次一定要跑胶回收
祝好
可以朝九晚五,也能浪迹天涯
8楼2012-11-06 16:37:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答

475502411

铜虫 (著名写手)

他们有公用的Buffer,但是在这个公用Buffer中的活性怎么样?如果活性太低的话要延长酶切时间的。
其实单酶切是可以的,不用醇沉,我经常做
你先用一个酶切,然后不要跑胶直接回收
然后再有另外一个酶切
都选他们活性最高的Buffer
第二个酶切后再跑胶回收
这样是不会有任何问题的应该就能切开了
但是要保证你的浓度,用第一个酶切的时候可以多做两管,用一个柱子回收,然后再用少量的洗脱液洗脱就好了、
祝你顺利
可以朝九晚五,也能浪迹天涯
2楼2012-11-06 11:29:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jiangyinshen

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
牧歌ping: 金币+1, 有帮助 2012-11-07 09:28:10
体系需要优化,酶切时间要延长,最好过夜,再做不出来的话就换试剂了
不是風動,亦非幡動,仁者心動
3楼2012-11-06 12:02:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
牧歌ping: 金币+2 2012-11-07 09:28:02
楼主的目的片段怎么得来的?PCR然后胶回收吗?如果是胶回收的话,胶回收过程的乙醇对酶切影响很大,乙醇一定要挥发干。。。
keepon
4楼2012-11-06 14:02:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的? +17 爱看书的可乐 2026-08-26 19/950 2026-08-30 22:24 by xiangy672
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +7 德尚中行 2026-08-27 8/400 2026-08-30 20:52 by purplejack
[基金申请] 29号明天会评吗 +3 笨笨唐 2026-08-28 3/150 2026-08-30 09:29 by cww8181
[基金申请] 我就是申请一个面上项目而已,这评审意见是按照杰青的条件评的吧? +6 gouxfjh 2026-08-28 11/550 2026-08-30 07:57 by gouxfjh
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗? +4 349506619 2026-08-28 4/200 2026-08-29 22:41 by alongwaytogo
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 系统查不到 +11 董八千 2026-08-26 11/550 2026-08-28 18:06 by Leogzhya
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 哪位高人中了,把查询到的截图贴出来让我看看,让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 看板上这么多中的,有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜? 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 国际合作可查了,中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 国合现在查不到了吗? +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 某些机构,以效率低为荣,以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
信息提示
请填处理意见