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双酶切问题，跪求指导啊
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各位大牛，谁来帮帮我啊，我最近做双酶切，目的片段500左右，连载pmd18-simple-t载体上，用的是NEB公司的not1和bamh1两个酶进行酶切，测序序列正确，可是not1就是切不动，not1我已经验证过了好用，什么单切，过夜切,都试过了，我用的是20ul体系酶各加0.5,单切10ul,20ul都用过了，。。。神了啊 ，这种情况我改怎么办啊 |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-08 17:22:10
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你说得不是很清楚。我的理解是： 你已经将500bp的片段克隆至载体pmd-simple-t了，现在准备用NotI+BamHI将此500bp片段切下来（可能准备亚克隆？），问题出在双酶切上，对吧？ 如果上述推测正确，那么我建议你先对你的质粒DNA进行定量，然后各取1ugDNA,分别用NotI或BamHI进行单酶切，看看此两个酶切位点是否都能成功进行单切。（质粒成功进行单酶切后电泳的带型与未酶切的质粒不一样，电泳可以明显分辨）。 然后再考虑双酶切。 酶切时的两种酶的具体用量，我建议你利用double digestion designer(http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php)进行计算，不要随意估计，以确保完全酶切或者不会因酶量过多而出现酶的星活性。 |
2楼2013-10-08 16:55:27
sxxuan
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dang_qi
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