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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 双酶切问题，跪求指导啊
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蛀虫英

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切问题，跪求指导啊

各位大牛，谁来帮帮我啊，我最近做双酶切，目的片段500左右，连载pmd18-simple-t载体上，用的是NEB公司的not1和bamh1两个酶进行酶切，测序序列正确，可是not1就是切不动，not1我已经验证过了好用，什么单切，过夜切,都试过了，我用的是20ul体系酶各加0.5,单切10ul,20ul都用过了，。。。神了啊，这种情况我改怎么办啊
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1楼 2013-10-08 14:46:26
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-08 17:22:10
你说得不是很清楚。我的理解是：
你已经将500bp的片段克隆至载体pmd-simple-t了，现在准备用NotI+BamHI将此500bp片段切下来（可能准备亚克隆？），问题出在双酶切上，对吧？
如果上述推测正确，那么我建议你先对你的质粒DNA进行定量，然后各取1ugDNA,分别用NotI或BamHI进行单酶切，看看此两个酶切位点是否都能成功进行单切。（质粒成功进行单酶切后电泳的带型与未酶切的质粒不一样，电泳可以明显分辨）。
然后再考虑双酶切。
酶切时的两种酶的具体用量，我建议你利用double digestion designer(http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php)进行计算，不要随意估计，以确保完全酶切或者不会因酶量过多而出现酶的星活性。
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2楼2013-10-08 16:55:27
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sxxuan

金虫 (著名写手)

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-08 17:22:16
可以看看notI的酶切位点有没有突变
按楼上的建议测浓度，或做个质粒用量梯度来切一下
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你的日子如何，你的力量也必如何！
3楼2013-10-08 17:16:03
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leonaliu2013

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-08 17:22:27
你的描述不太清楚，你说Not1好用，指的是你用这个酶单切切的是你这个片段，还是只是为了验证这个酶是否好用而切得其他带有Not1酶切位点的片段。如果你切的是你自己的片段，那么单酶切能切开，双酶切切不开，那么你要考虑你用的buffer和反应条件是否不适合Not1，但是如果你的意思是你只是单纯的验证了你的Not1好用，而用这个酶切不开你的片段，那么建议你只用Not1单酶切，如果切不开那么是引物合成的公司可能给你合成错了酶切位点。我遇到过这种情况
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4楼2013-10-08 17:17:41
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ndsc

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-08 17:22:36
同学你好，我建议你把克隆的载体送测序，或是直接重新合成引物，因为原因只有一个，那就是合成引物的5‘端出现碱基错误。。。

得到测序结果可以申请重新合成引物，并且赠送测序券，如果你赶时间那还是直接重新合成吧，时间不等人啊。
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5楼2013-10-08 17:19:47
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dang_qi

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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目的片段500的话两个酶切位点比较近，三维结构情况下更近了，你可以试试分别进行两次单酶切试试。
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手指所触碰到的距离必有你所期待的风景.
6楼2013-10-08 17:22:21
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