应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切后目的条带的疑问？
91/1返回列表
查看: 4514  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

lixilei1314

金虫 (小有名气)

[求助] 双酶切后目的条带的疑问？

如何：
小弟最近在做重组质粒的双酶切，然后连接。
1，连接以后转化BL21培养基筛选，老是不长细菌，基本上平板上一个细菌都不长，不知道是什么原因？没连接好？
2，看我双酶切的条带，PET-28双酶切之后条带很暗很暗（3ul的上样量），同样，第一个和第二个的目的条带也很暗，第三个目的条带比较亮。请问各位大侠这样的条带可以割胶回收做连接吗？
3， 为什么双酶切之后，克隆载体亮度会比目的条带的亮度亮很多呢？按说他们的浓度应该是一样的啊？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-08-21 16:38:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lixilei1314: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢，晚上就做个空载体对照看看。 2012-08-22 13:27:15
1：做个对照试验没，转一下空载体，看看长不长，然后确定是不是连接的问题
2：载体和第一、第二个目的条带，量太少了，再加上回收过程中的损失，估计会看不到了，如果你想用于做连接，那就多切点吧。第三个目的条带，看在浓度还可以
3：浓度相同，但是片段大小却不相同
赞一下 回复此楼
2楼2012-08-22 06:05:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyk81

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lixilei1314: 金币+2, 总体系40ul，可能还是量太少了。 2012-08-22 13:28:38
酶切体系总体积是多少?上了3uL，还剩下多少?如果还剩下47uL， 全上样跑胶回收，否则重做，因为你的目的带比DL2000还弱，应该不足50ng，太少了，如果回收后这么多还有可能连接成功。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
学无止境！
3楼2012-08-22 07:43:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

实心小白菜

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助，热心的虫虫 2012-08-22 15:13:28
你这是大切的验证么？可以把剩下的全跑个回收胶瞅瞅，回收的时候弄的终体积小点，然后就能浓度大点，跑个电泳看看回收后浓度，如果还有这么浅，那就能连上。如果消失了，就多切点重切吧，呼呼。而且很明显你个第一个第二个切的少了，载体才那个亮度，你指望比它短那么多的片段能多多少。
赞一下 回复此楼
有啥不高兴的事儿，说出来大家乐呵乐呵~
4楼2012-08-22 08:09:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tanglian8655

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lixilei1314: 金币+2, 第一个和第二个是同一个基因。 2012-08-22 13:30:38
你三个孔的目的基因是同一个基因吗
赞一下 回复此楼
5楼2012-08-22 11:06:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

M110935

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lixilei1314: 金币+2, 操作应该是对了，昨晚刚换了新了抗生素，还是没长东西。对了，我用的酶是TAKARA的NcoI 和Xho I 双酶切，说明书上说的XhoI切除的末端连接效率很低，需要用平滑末端的连接条件，请问平滑末端的连接条件是什么样子的？我就是延长连接时间，16度连接16小时。 2012-08-22 13:34:00
我也有过这种情况，双酶切切出来的目的条带比你这这个还浅，但测序是对的。你说涂板后细菌几乎不长，是不是你在涂板的时候，酒精灯烧过的玻璃棒不等冷却就直接用了？或者青霉素抗性弄错了？
赞一下 回复此楼
6楼2012-08-22 11:50:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

新标签页

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

摩尔数一样的，但是条带的亮暗是看的纳克数，就是DNA的分子量。因此同样的摩尔数，片段越长，亮度越大。
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2013-03-04 21:33:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

安琪儿水晶

金虫 (正式写手)
我的双酶切切除来是载体片段稍大，目地片段较小，怎么回事？而且单酶切和双酶切切出来一样的效果。但是用重组菌做pcr可以扩出目的条带，这是怎么回事？

20130118扩增酶连产物.jpg



20130306top酶切.jpg
赞一下 回复此楼
相信自己，总会好的！
8楼2013-03-08 15:19:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hao327791557

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我最近也做双酶切，不长菌 应该就是在连接上出现问题了，你在换下空载体试试，换其他的感受态试试，希望能帮助你。
赞一下 回复此楼
不懈
9楼2013-07-21 11:48:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 lixilei1314 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 4/200 2026-09-29 16:47 by yCO1Ll7aHtsw
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 4/200 2026-09-29 16:37 by etmYJ6d2rquH
[博后之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 16:30 by etmYJ6d2rquH
[硕博家园] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 16:03 by etmYJ6d2rquH
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 tqUTOxClQUMF 2026-09-28 3/150 2026-09-29 15:46 by etmYJ6d2rquH
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 3/150 2026-09-29 14:30 by etmYJ6d2rquH
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 CfXuS1rDhLYN 2026-09-28 3/150 2026-09-29 14:24 by etmYJ6d2rquH
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +6 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 6/300 2026-09-29 14:13 by etmYJ6d2rquH
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +6 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 7/350 2026-09-29 14:07 by etmYJ6d2rquH
[博后之家] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 3/150 2026-09-29 13:56 by etmYJ6d2rquH
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 5/250 2026-09-29 13:50 by etmYJ6d2rquH
[教师之家] 某top大学教授说“能够在市场中兑现的能力才是真能力”无比同意！ +8 zju2000 2026-09-26 9/450 2026-09-29 13:47 by ahsoarli
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 tqUTOxClQUMF 2026-09-28 3/150 2026-09-29 09:59 by JzYBbHIXWSrW
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 06:42 by ZvyPK8n6Nfki
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 CfXuS1rDhLYN 2026-09-28 4/200 2026-09-28 22:55 by ez6fGg9abYaj
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 4/200 2026-09-28 22:55 by ez6fGg9abYaj
[有机交流] 同一个分子，一条来自文献，一条来自AI——不告诉你答案，你会选哪条？ +3 tianxiaoxian 2026-09-28 6/300 2026-09-28 22:44 by tianxiaoxian
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 6/300 2026-09-28 22:15 by ez6fGg9abYaj
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 CfXuS1rDhLYN 2026-09-28 3/150 2026-09-28 19:08 by 9lS3ad5oOymn
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 4/200 2026-09-28 18:51 by 9lS3ad5oOymn
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭