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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切后目的条带的疑问？
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lixilei1314

金虫 (小有名气)

[求助] 双酶切后目的条带的疑问？

如何：
小弟最近在做重组质粒的双酶切，然后连接。
1，连接以后转化BL21培养基筛选，老是不长细菌，基本上平板上一个细菌都不长，不知道是什么原因？没连接好？
2，看我双酶切的条带，PET-28双酶切之后条带很暗很暗（3ul的上样量），同样，第一个和第二个的目的条带也很暗，第三个目的条带比较亮。请问各位大侠这样的条带可以割胶回收做连接吗？
3， 为什么双酶切之后，克隆载体亮度会比目的条带的亮度亮很多呢？按说他们的浓度应该是一样的啊？
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1楼 2012-08-21 16:38:40
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lixilei1314: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢，晚上就做个空载体对照看看。 2012-08-22 13:27:15
1：做个对照试验没，转一下空载体，看看长不长，然后确定是不是连接的问题
2：载体和第一、第二个目的条带，量太少了，再加上回收过程中的损失，估计会看不到了，如果你想用于做连接，那就多切点吧。第三个目的条带，看在浓度还可以
3：浓度相同，但是片段大小却不相同
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2楼2012-08-22 06:05:43
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yyk81

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lixilei1314: 金币+2, 总体系40ul，可能还是量太少了。 2012-08-22 13:28:38
酶切体系总体积是多少?上了3uL，还剩下多少?如果还剩下47uL， 全上样跑胶回收，否则重做，因为你的目的带比DL2000还弱，应该不足50ng，太少了，如果回收后这么多还有可能连接成功。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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学无止境！
3楼2012-08-22 07:43:00
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实心小白菜

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助，热心的虫虫 2012-08-22 15:13:28
你这是大切的验证么？可以把剩下的全跑个回收胶瞅瞅，回收的时候弄的终体积小点，然后就能浓度大点，跑个电泳看看回收后浓度，如果还有这么浅，那就能连上。如果消失了，就多切点重切吧，呼呼。而且很明显你个第一个第二个切的少了，载体才那个亮度，你指望比它短那么多的片段能多多少。
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有啥不高兴的事儿，说出来大家乐呵乐呵~
4楼2012-08-22 08:09:45
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tanglian8655

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lixilei1314: 金币+2, 第一个和第二个是同一个基因。 2012-08-22 13:30:38
你三个孔的目的基因是同一个基因吗
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5楼2012-08-22 11:06:49
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M110935

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lixilei1314: 金币+2, 操作应该是对了，昨晚刚换了新了抗生素，还是没长东西。对了，我用的酶是TAKARA的NcoI 和Xho I 双酶切，说明书上说的XhoI切除的末端连接效率很低，需要用平滑末端的连接条件，请问平滑末端的连接条件是什么样子的？我就是延长连接时间，16度连接16小时。 2012-08-22 13:34:00
我也有过这种情况，双酶切切出来的目的条带比你这这个还浅，但测序是对的。你说涂板后细菌几乎不长，是不是你在涂板的时候，酒精灯烧过的玻璃棒不等冷却就直接用了？或者青霉素抗性弄错了？
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6楼2012-08-22 11:50:44
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铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

摩尔数一样的，但是条带的亮暗是看的纳克数，就是DNA的分子量。因此同样的摩尔数，片段越长，亮度越大。
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7楼2013-03-04 21:33:13
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安琪儿水晶

金虫 (正式写手)
我的双酶切切除来是载体片段稍大，目地片段较小，怎么回事？而且单酶切和双酶切切出来一样的效果。但是用重组菌做pcr可以扩出目的条带，这是怎么回事？

20130118扩增酶连产物.jpg



20130306top酶切.jpg
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相信自己，总会好的！
8楼2013-03-08 15:19:35
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hao327791557

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我最近也做双酶切，不长菌 应该就是在连接上出现问题了，你在换下空载体试试，换其他的感受态试试，希望能帮助你。
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不懈
9楼2013-07-21 11:48:06
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