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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】双酶切大问题
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大白菜123789

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】双酶切大问题

兄弟姐妹们，近期本人正在构建干扰载体，可在做双酶切鉴定时，总是出现如下问题：
双酶切时，并没有目的片段（500）+大载体片段（13000）出现，反之，出现了三条大片段（>5000）！！！换了几对酶，都是如此的结果!想不通……

请各位大侠及有关部门，给予帮助，谢了……
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1楼 2010-11-25 21:35:50
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feiye2214

木虫 (正式写手)
★
大白菜123789(金币+1):谢谢参与
大白菜123789(金币+1): 2010-11-26 10:45:44
引用回帖:
Originally posted by 大白菜123789 at 2010-11-25 21:35:50:
兄弟姐妹们，近期本人正在构建干扰载体，可在做双酶切鉴定时，总是出现如下问题：
双酶切时，并没有目的片段（500）+大载体片段（13000）出现，反之，出现了三条大片段（>5000）！！！换了几对酶，都是如此的 ...

要不先用单酶切试试？
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2楼2010-11-25 21:47:17
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米菲的旋律

木虫 (著名写手)
★
大白菜123789(金币+1):谢谢参与
大白菜123789(金币+1): 2010-11-26 10:47:01
有没有认真检查插入序列和载体上的酶切位点啊，如果检查好了，那就排除用错酶。
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3楼2010-11-25 21:50:37
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clarktao

木虫之王 (文学泰斗)
★
大白菜123789(金币+1):谢谢参与
大白菜123789(金币+1): 2010-11-26 10:47:11
学习了哦
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4楼2010-11-25 21:58:22
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)
★
大白菜123789(金币+1):谢谢参与
大白菜123789(金币+1): 2010-11-26 10:47:16
引用回帖:
Originally posted by 大白菜123789 at 2010-11-25 21:35:50:
兄弟姐妹们，近期本人正在构建干扰载体，可在做双酶切鉴定时，总是出现如下问题：
双酶切时，并没有目的片段（500）+大载体片段（13000）出现，反之，出现了三条大片段（>5000）！！！换了几对酶，都是如此的 ...

不明真相。。。

难道载体里有你不知道的酶切位点？因为好多质粒都有可能会用错的
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5楼2010-11-25 23:20:48
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我是懒人

铁虫 (初入文坛)
★
大白菜123789(金币+1):谢谢参与
大白菜123789(金币+1): 2010-11-26 10:47:20
给你老板建议换gateway cloning。。。。。虽然花些钱但很简单。。。。
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6楼2010-11-26 00:13:10
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大白菜123789

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by feiye2214 at 2010-11-25 21:47:17:

要不先用单酶切试试？

呵呵，单酶切也做过了，大载体的带型是合适的，目的片段的带大了2000左右，还是不对啊，呵呵
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7楼2010-11-26 10:49:02
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大白菜123789

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 米菲的旋律 at 2010-11-25 21:50:37:
有没有认真检查插入序列和载体上的酶切位点啊，如果检查好了，那就排除用错酶。

这个应该没有问题，师兄刚做过，同样的东西，可以做出来
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8楼2010-11-26 10:50:20
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
★
大白菜123789(金币+1):谢谢参与
双酶切没有切开？
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9楼2010-11-26 10:57:31
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feiye2214

木虫 (正式写手)
★
大白菜123789(金币+1):谢谢参与
大白菜123789(金币+1): 2010-11-27 09:14:07
引用回帖:
Originally posted by 大白菜123789 at 2010-11-26 10:49:02:

呵呵，单酶切也做过了，大载体的带型是合适的，目的片段的带大了2000左右，还是不对啊，呵呵

酶切后去测序吧，不要纠结在捉摸酶切和体系问题上了，把切来的小片段去测序和你重组前的序列比对下，看看多出哪些序列了再分析酶切位点的错位问题
其实酶切温度不适会使酶产生星活性，乱切一气
祝顺利
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10楼2010-11-26 11:22:48
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zhengchenx

禁虫 (著名写手)
★
大白菜123789(金币+1):谢谢参与
本帖内容被屏蔽
11楼2010-11-26 11:28:05
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feng__

金虫 (著名写手)
★
大白菜123789(金币+1):谢谢参与
大白菜123789(金币+1): 2010-11-27 09:11:11
有的时候做试验的确挺诡异的，或者你过段时间就又没问题了，呵呵


还有就是你的酶或者BUFFER  H2O什么的被污染了？全部换新的再来一次试试
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12楼2010-11-26 15:27:22
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feng__

金虫 (著名写手)
★
大白菜123789(金币+1):谢谢参与
暂时想到的就这么多
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13楼2010-11-26 15:27:47
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yqhc

金虫 (小有名气)
★
大白菜123789(金币+1):谢谢参与
有可能酶切没有完全，再试一次。goodluck
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14楼2010-11-26 22:07:15
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sunwei57

木虫 (小有名气)
★
大白菜123789(金币+1): 谢谢参与
这完全是质粒的三条带,该质粒里应该没有你的外源片断,这是质粒的自连,估计你得重新连接挑选阳性克隆
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15楼2012-03-17 11:52:43
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