应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】双酶切的问题
251/3返回列表123下一页
查看: 1846  |  回复: 24
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

睡着数绵羊

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】双酶切的问题 已有12人参与

提出来的重组质粒酶切后好像是空的，可能是没有连上，那怎么确定我的目的片段切开了没啊，在设计引物时前面加了保护碱基，这样的话我需不需要再过T载体那？向各位请教！！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2010-07-21 23:18:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
reasonspare(金币+2):兄弟幽默了 2010-07-22 07:07:46
引用回帖:
Originally posted by 睡着数绵羊 at 2010-07-21 23:18:02:
提出来的重组质粒酶切后好像是空的，可能是没有连上，那怎么确定我的目的片段切开了没啊，在设计引物时前面加了保护碱基，这样的话我需不需要再过T载体那？向各位请教！！！

你的问题好复杂~~~
电泳时以空载体质粒做对照，能确定你是否连上~

加不加保护碱基和ta克隆没对应关系~
关键是taq酶有没有加上a尾~

还是做ta克隆吧，在从上面切下来，免得直接连载体时搞不清楚是哪步出错~~~
赞一下(2人) 回复此楼
小木虫之有关部门负责人
2楼2010-07-22 00:02:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zal

木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-07-22 07:07:59
双酶切上载体没有问题的，你在看看是不是还有其他问题，比如载体是否酶切完全，一般要过夜没切，另外连接时载体和目的条带的比例也有影响，再试试，祝顺利！
赞一下(1人) 回复此楼
欲求其上，必先上上
3楼2010-07-22 01:27:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看天(金币+3):鼓励交流 2010-07-22 12:20:33
如果直接双酶切载体和片段做连接的话，载体是否切开好验证，片段是否切开就不好验证了。
不过，我的经验是可以单酶切载体，验证两个酶没问题。然后取100-200 ng 的片段进行双酶切，酶各1 uL，体系可适当放大，30 ul左右，多切几管，乙醇沉淀或用盒子回收浓缩，再做连接。
总结就是，一个酶切体系尽量少加片段，从而保证片段完全切开。再浓缩保证连接时片段较浓，保证片段：载体=2:1~10:1（摩尔比）。
赞一下(2人) 回复此楼
Thank-you，so-blue.
4楼2010-07-22 10:49:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 睡着数绵羊 at 2010-07-21 23:18:02:
提出来的重组质粒酶切后好像是空的，可能是没有连上，那怎么确定我的目的片段切开了没啊，在设计引物时前面加了保护碱基，这样的话我需不需要再过T载体那？向各位请教！！！

我现在也搞不清楚是哪里的问题啊，就担心是不是没切开啊，不过T载体就不需要加A尾吧，就是说加了保护碱基就不用过T载体了，在设计引物的时候就是这么打算的!现在该怎么办那？
赞一下 回复此楼
5楼2010-07-23 11:19:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by scelab at 2010-07-22 00:02:19:

你的问题好复杂~~~
电泳时以空载体质粒做对照，能确定你是否连上~

加不加保护碱基和ta克隆没对应关系~
关键是taq酶有没有加上a尾~

还是做ta克隆吧，在从上面切下来，免得直接连载体时搞不清楚是哪步出错 ...

我现在也搞不清楚是哪里的问题啊，就担心是不是没切开啊，不过T载体就不需要加A尾吧，就是说加了保护碱基就不用过T载体了，在设计引物的时候就是这么打算的!现在该怎么办那？
赞一下 回复此楼
6楼2010-07-23 11:24:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zal at 2010-07-22 01:27:57:
双酶切上载体没有问题的，你在看看是不是还有其他问题，比如载体是否酶切完全，一般要过夜没切，另外连接时载体和目的条带的比例也有影响，再试试，祝顺利！

载体单，双都酶切了，3H就能切开，目的片段我切过夜的
赞一下 回复此楼
7楼2010-07-23 11:25:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-07-22 10:49:31:
如果直接双酶切载体和片段做连接的话，载体是否切开好验证，片段是否切开就不好验证了。
不过，我的经验是可以单酶切载体，验证两个酶没问题。然后取100-200 ng 的片段进行双酶切，酶各1 uL，体系可适当放大，30 ...

载体我都单，双酶切了 没有问题，就是担心目的片段是否切开？
赞一下 回复此楼
8楼2010-07-23 11:28:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zal

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 睡着数绵羊 at 2010-07-23 11:25:24:

载体单，双都酶切了，3H就能切开，目的片段我切过夜的

载体还是过夜切好！
赞一下(1人) 回复此楼
欲求其上，必先上上
9楼2010-07-23 12:55:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

louli

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你的目的片段和载体连上之后，也就是转化之前，跑胶验证了吗？如果是两条带就没连上，证明没切开
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2010-07-23 20:01:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 睡着数绵羊 的主题更新
251/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 本人考085602 化学工程 专硕 +7 不知道叫什么！ 2026-03-15 8/400 2026-03-15 20:11 by 棒棒球手
[考研] 304求调剂 +5 小熊joy 2026-03-14 5/250 2026-03-14 21:07 by peike
[考研] 【0703化学调剂】-一志愿华中师范大学-六级475 +5 Becho359 2026-03-11 5/250 2026-03-14 11:35 by 哦哦123
[考研] 材料080500调剂求收留 +3 一颗meteor 2026-03-13 3/150 2026-03-14 10:54 by peike
[考研] 一志愿浙江大学0856材料与化工求调剂 +4 yansheng@211 2026-03-09 5/250 2026-03-14 02:10 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 +6 yfihxh 2026-03-09 6/300 2026-03-14 01:18 by JourneyLucky
[考研] 材料工程专硕，一志愿中国矿业大学，总分314，求调剂 +5 无懈可击的巨人 2026-03-10 5/250 2026-03-14 00:37 by JourneyLucky
[考研] 321求调剂 +3 CUcat 2026-03-10 3/150 2026-03-14 00:25 by JourneyLucky
[考研] 四川大学085601材料工程专硕 初试294求调剂 +4 祝我们好在冬天 2026-03-11 4/200 2026-03-13 21:39 by peike
[考研] 【考研调剂求收留】 +3 Ceciilia 2026-03-11 3/150 2026-03-13 20:18 by JourneyLucky
[考研] 301求调剂 +6 Liyouyumairs 2026-03-11 6/300 2026-03-13 20:11 by JourneyLucky
[考研] 材料工程调剂 +4 咪咪空空 2026-03-11 4/200 2026-03-13 19:57 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 +7 18880831720 2026-03-11 7/350 2026-03-13 16:10 by JourneyLucky
[考研] 295求调剂 +3 小匕仔汁 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:17 by vgtyfty
[考研] 274求调剂 +3 S.H1 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:15 by JourneyLucky
[考研] 土木第一志愿276求调剂，科研和技能十分丰富，求新兴方向的导师收留 +3 土木小天才 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:01 by JourneyLucky
[考研] 材料调剂，307分 +13 张泳铭1 2026-03-09 17/850 2026-03-13 11:09 by 薛云鹏
[考研] 321求调剂（食品/专硕） +3 xc321 2026-03-12 6/300 2026-03-13 08:45 by xc321
[考研] 收调剂 +7 调剂的考研学生 2026-03-10 7/350 2026-03-10 17:57 by 麦茶汤圆
[考研] 085602化工求调剂 +7 董boxing 2026-03-10 7/350 2026-03-10 17:07 by BruceLiu320
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭