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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】双酶切的问题
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】双酶切的问题已有12人参与

提出来的重组质粒酶切后好像是空的，可能是没有连上，那怎么确定我的目的片段切开了没啊，在设计引物时前面加了保护碱基，这样的话我需不需要再过T载体那？向各位请教！！！
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1楼2010-07-21 23:18:02
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
reasonspare(金币+2):兄弟幽默了 2010-07-22 07:07:46
引用回帖:
Originally posted by 睡着数绵羊 at 2010-07-21 23:18:02:
提出来的重组质粒酶切后好像是空的，可能是没有连上，那怎么确定我的目的片段切开了没啊，在设计引物时前面加了保护碱基，这样的话我需不需要再过T载体那？向各位请教！！！

你的问题好复杂~~~
电泳时以空载体质粒做对照，能确定你是否连上~

加不加保护碱基和ta克隆没对应关系~
关键是taq酶有没有加上a尾~

还是做ta克隆吧，在从上面切下来，免得直接连载体时搞不清楚是哪步出错~~~
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小木虫之有关部门负责人
2楼2010-07-22 00:02:19
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zal

木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-07-22 07:07:59
双酶切上载体没有问题的，你在看看是不是还有其他问题，比如载体是否酶切完全，一般要过夜没切，另外连接时载体和目的条带的比例也有影响，再试试，祝顺利！
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欲求其上，必先上上
3楼2010-07-22 01:27:57
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看天(金币+3):鼓励交流 2010-07-22 12:20:33
如果直接双酶切载体和片段做连接的话，载体是否切开好验证，片段是否切开就不好验证了。
不过，我的经验是可以单酶切载体，验证两个酶没问题。然后取100-200 ng 的片段进行双酶切，酶各1 uL，体系可适当放大，30 ul左右，多切几管，乙醇沉淀或用盒子回收浓缩，再做连接。
总结就是，一个酶切体系尽量少加片段，从而保证片段完全切开。再浓缩保证连接时片段较浓，保证片段：载体=2:1~10:1（摩尔比）。
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Thank-you，so-blue.
4楼2010-07-22 10:49:31
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 睡着数绵羊 at 2010-07-21 23:18:02:
提出来的重组质粒酶切后好像是空的，可能是没有连上，那怎么确定我的目的片段切开了没啊，在设计引物时前面加了保护碱基，这样的话我需不需要再过T载体那？向各位请教！！！

我现在也搞不清楚是哪里的问题啊，就担心是不是没切开啊，不过T载体就不需要加A尾吧，就是说加了保护碱基就不用过T载体了，在设计引物的时候就是这么打算的!现在该怎么办那？
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5楼2010-07-23 11:19:53
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by scelab at 2010-07-22 00:02:19:

你的问题好复杂~~~
电泳时以空载体质粒做对照，能确定你是否连上~

加不加保护碱基和ta克隆没对应关系~
关键是taq酶有没有加上a尾~

还是做ta克隆吧，在从上面切下来，免得直接连载体时搞不清楚是哪步出错 ...

我现在也搞不清楚是哪里的问题啊，就担心是不是没切开啊，不过T载体就不需要加A尾吧，就是说加了保护碱基就不用过T载体了，在设计引物的时候就是这么打算的!现在该怎么办那？
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6楼2010-07-23 11:24:34
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zal at 2010-07-22 01:27:57:
双酶切上载体没有问题的，你在看看是不是还有其他问题，比如载体是否酶切完全，一般要过夜没切，另外连接时载体和目的条带的比例也有影响，再试试，祝顺利！

载体单，双都酶切了，3H就能切开，目的片段我切过夜的
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7楼2010-07-23 11:25:24
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-07-22 10:49:31:
如果直接双酶切载体和片段做连接的话，载体是否切开好验证，片段是否切开就不好验证了。
不过，我的经验是可以单酶切载体，验证两个酶没问题。然后取100-200 ng 的片段进行双酶切，酶各1 uL，体系可适当放大，30 ...

载体我都单，双酶切了 没有问题，就是担心目的片段是否切开？
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8楼2010-07-23 11:28:52
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zal

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 睡着数绵羊 at 2010-07-23 11:25:24:

载体单，双都酶切了，3H就能切开，目的片段我切过夜的

载体还是过夜切好！
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欲求其上，必先上上
9楼2010-07-23 12:55:42
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louli

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你的目的片段和载体连上之后，也就是转化之前，跑胶验证了吗？如果是两条带就没连上，证明没切开
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10楼2010-07-23 20:01:36
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