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lixilei1314

金虫 (小有名气)

[求助] 双酶切后目的条带的疑问?

如何:
小弟最近在做重组质粒的双酶切,然后连接。
1,连接以后转化BL21培养基筛选,老是不长细菌,基本上平板上一个细菌都不长,不知道是什么原因?没连接好?
2,看我双酶切的条带,PET-28双酶切之后条带很暗很暗(3ul的上样量),同样,第一个和第二个的目的条带也很暗,第三个目的条带比较亮。请问各位大侠这样的条带可以割胶回收做连接吗?
3, 为什么双酶切之后,克隆载体亮度会比目的条带的亮度亮很多呢?按说他们的浓度应该是一样的啊?
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lixilei1314: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢,晚上就做个空载体对照看看。 2012-08-22 13:27:15
1:做个对照试验没,转一下空载体,看看长不长,然后确定是不是连接的问题
2:载体和第一、第二个目的条带,量太少了,再加上回收过程中的损失,估计会看不到了,如果你想用于做连接,那就多切点吧。第三个目的条带,看在浓度还可以
3:浓度相同,但是片段大小却不相同
2楼2012-08-22 06:05:43
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yyk81

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lixilei1314: 金币+2, 总体系40ul,可能还是量太少了。 2012-08-22 13:28:38
酶切体系总体积是多少?上了3uL,还剩下多少?如果还剩下47uL, 全上样跑胶回收,否则重做,因为你的目的带比DL2000还弱,应该不足50ng,太少了,如果回收后这么多还有可能连接成功。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
学无止境!
3楼2012-08-22 07:43:00
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实心小白菜

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助,热心的虫虫 2012-08-22 15:13:28
你这是大切的验证么?可以把剩下的全跑个回收胶瞅瞅,回收的时候弄的终体积小点,然后就能浓度大点,跑个电泳看看回收后浓度,如果还有这么浅,那就能连上。如果消失了,就多切点重切吧,呼呼。而且很明显你个第一个第二个切的少了,载体才那个亮度,你指望比它短那么多的片段能多多少。
有啥不高兴的事儿,说出来大家乐呵乐呵~
4楼2012-08-22 08:09:45
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tanglian8655

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lixilei1314: 金币+2, 第一个和第二个是同一个基因。 2012-08-22 13:30:38
你三个孔的目的基因是同一个基因吗
5楼2012-08-22 11:06:49
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M110935

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lixilei1314: 金币+2, 操作应该是对了,昨晚刚换了新了抗生素,还是没长东西。对了,我用的酶是TAKARA的NcoI 和Xho I 双酶切,说明书上说的XhoI切除的末端连接效率很低,需要用平滑末端的连接条件,请问平滑末端的连接条件是什么样子的?我就是延长连接时间,16度连接16小时。 2012-08-22 13:34:00
我也有过这种情况,双酶切切出来的目的条带比你这这个还浅,但测序是对的。你说涂板后细菌几乎不长,是不是你在涂板的时候,酒精灯烧过的玻璃棒不等冷却就直接用了?或者青霉素抗性弄错了?
6楼2012-08-22 11:50:44
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铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

摩尔数一样的,但是条带的亮暗是看的纳克数,就是DNA的分子量。因此同样的摩尔数,片段越长,亮度越大。
7楼2013-03-04 21:33:13
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安琪儿水晶

金虫 (正式写手)

我的双酶切切除来是载体片段稍大,目地片段较小,怎么回事?而且单酶切和双酶切切出来一样的效果。但是用重组菌做pcr可以扩出目的条带,这是怎么回事?

20130118扩增酶连产物.jpg



20130306top酶切.jpg

相信自己,总会好的!
8楼2013-03-08 15:19:35
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hao327791557

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我最近也做双酶切,不长菌 应该就是在连接上出现问题了,你在换下空载体试试,换其他的感受态试试,希望能帮助你。
不懈
9楼2013-07-21 11:48:06
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