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dongyan08

木虫 (正式写手)

[交流] 双酶切啥都没有? 已有5人参与

麻烦各位帮我分析下我的双酶切后跑胶什么都没有哦!我的是PCR产物回收的片段,设计了保护碱基,用的是HindIII和KpnI酶切,酶切过夜,之后跑胶什么都没有,只有MARKER,切4个小时后跑胶也是什么都没有,同样的酶用来切质粒倒是能跑出比较亮的条带,PCR产物酶切之前跑胶还是挺亮的但酶切之后就什么都没有,也不知道为什么,感觉酶应该没有问题。到底是什么原因呢?不敢切下去了,麻烦各位高手指教指教。谢谢!
     酶都是TAKARA的,新买的,能切开质粒,应该没问题吧。而且PCR时引物还加了保护碱基。

[ Last edited by dongyan08 on 2012-7-9 at 21:18 ]
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wangcongxs

银虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
时间还是长了?我用HPa2/Msp1和EcoR1分别做双酶切,切的是DNA模板,也经常跑胶后什么都没有……纠结啊
做最好的自己
2楼2012-07-10 09:50:54
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lw19850128

银虫 (小有名气)

回收有问题不?
3楼2012-07-10 12:35:26
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dongyan08

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lw19850128 at 2012-07-10 12:35:26
回收有问题不?

回收没有问题,回收完了之后还跑了胶,挺亮的
4楼2012-07-10 14:29:01
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tyw2623

金虫 (小有名气)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-11 13:37:01
目前夏天   天气热  建议楼主所有的试管 枪头要灭菌,防止有外源DNA酶污染,  pcr产物回收相关试剂盒保证没有外源酶污染   尤其是最后一步的洗脱溶液 一定要保证无污染。。。。祝顺利
水遁
5楼2012-07-10 19:26:33
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tyw2623

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
一般4-5hs酶切时间足够,过夜酶切容易有星片段,和外源酶充分发挥降解作用
水遁
6楼2012-07-10 19:28:39
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hzlatqh

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
嗯 推测也是PCR回收试剂盒溶液有DNA酶污染,下回做酶切的时候可以做个不加内切酶的对照看看。
两个黄鹂鸣翠柳,一行白鹭上青天
7楼2012-07-10 22:12:58
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dongyan08

木虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by hzlatqh at 2012-07-10 22:12:58
嗯 推测也是PCR回收试剂盒溶液有DNA酶污染,下回做酶切的时候可以做个不加内切酶的对照看看。

回收以后跑胶检测有挺亮的带的,应该不是回收的问题吧
8楼2012-07-14 00:08:09
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hzlatqh

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by dongyan08 at 2012-07-14 00:08:09
回收以后跑胶检测有挺亮的带的,应该不是回收的问题吧...

回收之后一般都冻存起来,可能看不出来污染没污染。但酶切的时候需要温浴,有可能这个时候DNA酶作用才明显。。。
两个黄鹂鸣翠柳,一行白鹭上青天
9楼2012-07-14 19:33:37
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我晴天一片

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by tyw2623 at 2012-07-10 19:26:33
目前夏天   天气热  建议楼主所有的试管 枪头要灭菌,防止有外源DNA酶污染,  pcr产物回收相关试剂盒保证没有外源酶污染   尤其是最后一步的洗脱溶液 一定要保证无污染。。。。祝顺利

如果被污染了要怎么处理呢??
10楼2013-06-24 22:20:51
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