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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切啥都没有？
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dongyan08

木虫 (正式写手)

[交流] 双酶切啥都没有？ 已有5人参与

麻烦各位帮我分析下我的双酶切后跑胶什么都没有哦！我的是PCR产物回收的片段，设计了保护碱基，用的是HindIII和KpnI酶切，酶切过夜，之后跑胶什么都没有，只有MARKER,切4个小时后跑胶也是什么都没有，同样的酶用来切质粒倒是能跑出比较亮的条带，PCR产物酶切之前跑胶还是挺亮的但酶切之后就什么都没有，也不知道为什么，感觉酶应该没有问题。到底是什么原因呢？不敢切下去了，麻烦各位高手指教指教。谢谢！
     酶都是TAKARA的，新买的，能切开质粒，应该没问题吧。而且PCR时引物还加了保护碱基。

[ Last edited by dongyan08 on 2012-7-9 at 21:18 ]
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1楼 2012-07-09 21:12:54
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wangcongxs

银虫 (著名写手)
★
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时间还是长了？我用HPa2/Msp1和EcoR1分别做双酶切，切的是DNA模板，也经常跑胶后什么都没有……纠结啊
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做最好的自己
2楼2012-07-10 09:50:54
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lw19850128

银虫 (小有名气)
回收有问题不？
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3楼2012-07-10 12:35:26
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dongyan08

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lw19850128 at 2012-07-10 12:35:26
回收有问题不？

回收没有问题，回收完了之后还跑了胶，挺亮的
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4楼2012-07-10 14:29:01
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tyw2623

金虫 (小有名气)
★ ★
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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-11 13:37:01
目前夏天   天气热  建议楼主所有的试管 枪头要灭菌，防止有外源DNA酶污染，  pcr产物回收相关试剂盒保证没有外源酶污染   尤其是最后一步的洗脱溶液 一定要保证无污染。。。。祝顺利
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水遁
5楼2012-07-10 19:26:33
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tyw2623

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
一般4-5hs酶切时间足够，过夜酶切容易有星片段，和外源酶充分发挥降解作用
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水遁
6楼2012-07-10 19:28:39
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hzlatqh

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
嗯 推测也是PCR回收试剂盒溶液有DNA酶污染，下回做酶切的时候可以做个不加内切酶的对照看看。
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两个黄鹂鸣翠柳，一行白鹭上青天
7楼2012-07-10 22:12:58
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dongyan08

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by hzlatqh at 2012-07-10 22:12:58
嗯 推测也是PCR回收试剂盒溶液有DNA酶污染，下回做酶切的时候可以做个不加内切酶的对照看看。

回收以后跑胶检测有挺亮的带的，应该不是回收的问题吧
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8楼2012-07-14 00:08:09
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hzlatqh

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by dongyan08 at 2012-07-14 00:08:09
回收以后跑胶检测有挺亮的带的，应该不是回收的问题吧...

回收之后一般都冻存起来，可能看不出来污染没污染。但酶切的时候需要温浴，有可能这个时候DNA酶作用才明显。。。
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两个黄鹂鸣翠柳，一行白鹭上青天
9楼2012-07-14 19:33:37
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我晴天一片

新虫 (初入文坛)
★
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引用回帖:
5楼: Originally posted by tyw2623 at 2012-07-10 19:26:33
目前夏天   天气热  建议楼主所有的试管 枪头要灭菌，防止有外源DNA酶污染，  pcr产物回收相关试剂盒保证没有外源酶污染   尤其是最后一步的洗脱溶液 一定要保证无污染。。。。祝顺利

如果被污染了要怎么处理呢？？
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10楼2013-06-24 22:20:51
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