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junxiao0320

金虫 (小有名气)

[交流] 双酶切

用双酶切一个质粒，一个是76bp，一个是3400bp，用1%的胶和2%的胶都跑拉一遍，只有一条带3400bp，是那条太小吗？
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1楼 2011-10-19 19:48:03
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★ ★ ★
junxiao0320(金币+1):谢谢参与
wanhscn(金币+3): 鼓励应助！ 2011-10-22 15:31:18
76bp太小了吧，标记的marker不知道多大？
不要等电泳跑完再照相，不然基本看不到小的那条带。。。
可以等电泳跑上10分钟照一照，这样或许会看到。。。
不过我奇怪的是楼主为什么要看到那段76bp的条带呢？
对于你后期的实验有什么帮助或者别的什么原因呢？
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2楼2011-10-19 20:01:32
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friya0910

新虫 (正式写手)
★ ★
junxiao0320(金币+1):谢谢参与
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-10-22 15:31:29
引用回帖:
1楼: Originally posted by junxiao0320 at 2011-10-19 19:48:03:
用双酶切一个质粒，一个是76bp，一个是3400bp，用1%的胶和2%的胶都跑拉一遍，只有一条带3400bp，是那条太小吗？

把酶切质粒浓度提高看看。
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3楼2011-10-19 20:37:31
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★ ★
junxiao0320(金币+1):谢谢参与
wanhscn(金币+3): 鼓励应助！ 2011-10-22 15:31:35
1. 加大质粒和上样量。我们一般用100~300ng的质粒，用20微升的酶切体系，然后跑10微升（留一半是防着电泳出问题，如样品孔漏之类的）。用小孔的胶，使样品更浓缩条带更亮。

2.缩短电泳时间，100V的话一般10分钟就可以了。跑久了75bp的条带就跑到胶外面了。
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4楼2011-10-19 21:01:54
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三目

木虫 (小有名气)
★ ★
junxiao0320(金币+1):谢谢参与
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-10-22 15:31:54
你可以分两次单酶切看看结果，不过你这个3400的，跟质粒有点难分开啊
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6楼2011-10-19 23:06:14
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)
★
junxiao0320(金币+1):谢谢参与
76bp
这么小，你得多切一些质粒，不然怎么看的到呢
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7楼2011-10-20 00:41:16
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nach

铜虫 (著名写手)
★
junxiao0320(金币+1):谢谢参与
?С
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8楼2011-10-20 05:01:23
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mlanqiang

木虫之王 (文学泰斗)
★
junxiao0320(金币+1):谢谢参与
太小了吧。
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9楼2011-10-20 06:35:03
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447585565

木虫 (正式写手)
★
junxiao0320(金币+1):谢谢参与
可能是76bp太小了跑出去了

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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10楼2011-10-20 08:47:37
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zc10052157

新虫 (正式写手)
★
junxiao0320(金币+1):谢谢参与
76bp  早跑出去了吧
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11楼2011-10-20 09:19:27
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junxiao0320

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 天使托 at 2011-10-19 20:01:32:
76bp太小了吧，标记的marker不知道多大？
不要等电泳跑完再照相，不然基本看不到小的那条带。。。
可以等电泳跑上10分钟照一照，这样或许会看到。。。
不过我奇怪的是楼主为什么要看到那段76bp的条带呢？
对于 ...

最小的marker标记是100bp，因为单酶切3476同双酶切效果相似，没有看到小的条带，所以不知道是否是单酶切还是双酶切。
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13楼2011-10-20 09:25:38
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kristine2011

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
junxiao0320(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-10-20 18:43:25
太小，控制电泳时间，marker选个50bp的ladder，还是多切点。但是切不开的话，后面的两条带也分不开，弄个长胶跑一次。不过你是什么目的呢，要回收76bp？
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14楼2011-10-20 10:29:21
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peace12039088

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
junxiao0320(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+2): 有道理啊 2011-10-20 18:43:45
如果不是回收的话，为什么非要看到76bp的带呢？76bp确实不够大，不易在胶上看到。如果你是想回收3kb多的片段再做下一步实验的话，那3kb多的片段上应该还有其它酶切位点吧，不知可否再选择其它合适的酶切位点来确定回收到的大片段是单酶切来还是双酶切来的。仅供参考
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15楼2011-10-20 10:53:54
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天使托

专家顾问 (职业作家)
引用回帖:
13楼: Originally posted by junxiao0320 at 2011-10-20 09:25:38:
最小的marker标记是100bp，因为单酶切3476同双酶切效果相似，没有看到小的条带，所以不知道是否是单酶切还是双酶切。

这个完全没有必要吧，你进行的是双酶切就可以了，关键还是在于你后期的连接了。。。
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16楼2011-10-20 12:29:34
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铅钋锶钇

银虫 (初入文坛)
★
junxiao0320(金币+1):谢谢参与
跑飞了，
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17楼2011-10-20 13:48:15
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lz7233504

铁虫 (小有名气)
★
junxiao0320(金币+1):谢谢参与
西瓜: 多写了个0哦，⊙﹏⊙b 2011-10-20 18:45:03
760bp一点不小  是lz没跑好吧 1%的胶足够了
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18楼2011-10-20 14:06:21
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junxiao0320

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 三目 at 2011-10-19 23:06:14:
你可以分两次单酶切看看结果，不过你这个3400的，跟质粒有点难分开啊

如果质粒没有经过酶切，是不是就是双螺旋，跟单酶切的条带是有区别的
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19楼2011-10-22 09:17:18
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junxiao0320

金虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by lz7233504 at 2011-10-20 14:06:21:
760bp一点不小  是lz没跑好吧 1%的胶足够了

是76
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20楼2011-10-22 09:17:47
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junxiao0320

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by peace12039088 at 2011-10-20 10:53:54:
如果不是回收的话，为什么非要看到76bp的带呢？76bp确实不够大，不易在胶上看到。如果你是想回收3kb多的片段再做下一步实验的话，那3kb多的片段上应该还有其它酶切位点吧，不知可否再选择其它合适的酶切位点来确定 ...

怎么用其他的酶，来确定是单酶切还是双酶切呢？
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21楼2011-10-22 09:19:49
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青豆同学

铜虫 (正式写手)
★
junxiao0320(金币+1):谢谢参与
太小太少
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22楼2011-10-22 13:19:02
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xiaoche

铜虫 (小有名气)
★
junxiao0320(金币+1):谢谢参与
你其实不用来证明吧？后期实验是用来连接的话，如果连接上，那说明是双酶切开了，其实双酶切很容易的。
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23楼2011-10-26 21:21:37
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junxiao0320

金虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by xiaoche at 2011-10-26 21:21:37:
你其实不用来证明吧？后期实验是用来连接的话，如果连接上，那说明是双酶切开了，其实双酶切很容易的。

奥，还想怕后期连不上又多一个可疑因素
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24楼2011-10-28 08:51:38
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lloveyr

金虫 (正式写手)
★
junxiao0320(金币+1):谢谢参与
76bp太小，要浓度很高才能看得见，电泳也不能电泳的太久。
如果只是为了确定是否切开的话，同时做双酶切和单酶切，1%胶跑得久一点，比较一下
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25楼2011-10-28 14:12:16
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简单回复
harbor20105楼
2011-10-19 21:11   回复  
junxiao0320(金币+1):谢谢参与
liangxiuyan12楼
2011-10-20 09:21   回复  
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