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双酶切没有切开，怎么回事啊
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本人最近想把目的片段连接在表达载体pET15b上，我的两条目的片段均约1000bp，下图为酶切回收前的鉴定图，左边15000的Marker，右边2000的Marker，15000Marker右边第一条带是pET15b质粒酶切的结果，第二条是T载体连目的片段的酶切结果，第三条什么也没有，第四条同样是pET15b质粒酶切的结果，第五条是T载体连另一目的片段的结果。 ysn20121015pet15b，T-t①，T-h⒄双酶切.jpg |
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gwd0312
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【答案】应助回帖
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建议你酶切前对质粒进行定量（可以直接用OD260或电泳分析的方法，详见分子克隆），然后根据你实验的需要，取适当的量进行酶切分析，一般来说：简单的酶切鉴定，酶切500ng-1ug的质粒DNA就足够了，如果需要回收载体大片段用于随后的基因克隆，则需要1-2ug的质粒DNA，如果回收小片段进行亚克隆，则需要2-4ug的质粒DNA. 更重要的是，为了确保质粒酶切完全或者避免出现酶的星活性，建议利用免费的double digestion designer软件进行双酶切的实验设计，可以确保质粒的完全酶切，或者避免因加的酶量太多而导致质粒DNA出现smear现象。祝一切顺利。 |
5楼2012-10-15 21:21:41
zhangby2002
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6楼2012-10-16 08:36:12
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7楼2012-10-16 09:34:00