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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切没有切开，怎么回事啊
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ysn5048

银虫 (小有名气)

[求助] 双酶切没有切开，怎么回事啊

本人最近想把目的片段连接在表达载体pET15b上，我的两条目的片段均约1000bp，下图为酶切回收前的鉴定图，左边15000的Marker，右边2000的Marker，15000Marker右边第一条带是pET15b质粒酶切的结果，第二条是T载体连目的片段的酶切结果，第三条什么也没有，第四条同样是pET15b质粒酶切的结果，第五条是T载体连另一目的片段的结果。

ysn20121015pet15b，T-t①，T-h⒄双酶切.jpg
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有时候，一句话，可以改变未来
1楼 2012-10-15 17:55:30
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议你把pET15b质粒也跑个电泳看一下，是不是质粒的问题！
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持之以恒、永不放弃！
2楼2012-10-15 18:09:38
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ysn5048

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-10-15 18:09:38
建议你把pET15b质粒也跑个电泳看一下，是不是质粒的问题！

这是我在酶切之前跑的质粒图，同样是15k的marker右边第一条是pET15b，另外两个是两条目的片段连接T载体的质粒

ysn20121015提取质粒pet15b，T-t①，T-h⒄.jpg
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有时候，一句话，可以改变未来
3楼2012-10-15 18:35:29
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水寒冰006

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉你要酶切的东西都已经降解了，体系用的水是不是有污染，但是一般来说质粒还是蛮稳定的，还有就是用的两个酶的buffer是不是共有的可以看一下。
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4楼2012-10-15 21:14:00
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ysn5048: 金币+4, ★★★很有帮助 2012-10-15 22:25:01
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-10-16 13:47:36
建议你酶切前对质粒进行定量（可以直接用OD260或电泳分析的方法，详见分子克隆），然后根据你实验的需要，取适当的量进行酶切分析，一般来说：简单的酶切鉴定，酶切500ng-1ug的质粒DNA就足够了，如果需要回收载体大片段用于随后的基因克隆，则需要1-2ug的质粒DNA，如果回收小片段进行亚克隆，则需要2-4ug的质粒DNA.
更重要的是，为了确保质粒酶切完全或者避免出现酶的星活性，建议利用免费的double digestion designer软件进行双酶切的实验设计，可以确保质粒的完全酶切，或者避免因加的酶量太多而导致质粒DNA出现smear现象。祝一切顺利。
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5楼2012-10-15 21:21:41
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zhangby2002

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ysn5048: 金币+1, ★有帮助 2012-10-16 13:22:09
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-16 13:47:45
做双酶切鉴定时要注意一下几点：1.首先检查一下看目的片段是否连接在载体上。2.看你选择的酶是否合适，并且具有相同的buffer,酶是否同一品牌。3.加样顺序是否正确。4.酶切体系以及反应等操作严格要求。 祝成功
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业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。
6楼2012-10-16 08:36:12
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rfengyi

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ysn5048: 金币+2, ★有帮助 2012-10-16 13:23:18
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流问题 2012-10-16 13:47:57
本帖内容被屏蔽
7楼2012-10-16 09:34:00
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