应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切没有切开，怎么回事啊
51/1返回列表
查看: 3214  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

ysn5048

银虫 (小有名气)

[求助] 双酶切没有切开，怎么回事啊

本人最近想把目的片段连接在表达载体pET15b上，我的两条目的片段均约1000bp，下图为酶切回收前的鉴定图，左边15000的Marker，右边2000的Marker，15000Marker右边第一条带是pET15b质粒酶切的结果，第二条是T载体连目的片段的酶切结果，第三条什么也没有，第四条同样是pET15b质粒酶切的结果，第五条是T载体连另一目的片段的结果。

ysn20121015pet15b，T-t①，T-h⒄双酶切.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
有时候，一句话，可以改变未来
1楼 2012-10-15 17:55:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ysn5048: 金币+4, ★★★很有帮助 2012-10-15 22:25:01
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-10-16 13:47:36
建议你酶切前对质粒进行定量（可以直接用OD260或电泳分析的方法，详见分子克隆），然后根据你实验的需要，取适当的量进行酶切分析，一般来说：简单的酶切鉴定，酶切500ng-1ug的质粒DNA就足够了，如果需要回收载体大片段用于随后的基因克隆，则需要1-2ug的质粒DNA，如果回收小片段进行亚克隆，则需要2-4ug的质粒DNA.
更重要的是，为了确保质粒酶切完全或者避免出现酶的星活性，建议利用免费的double digestion designer软件进行双酶切的实验设计，可以确保质粒的完全酶切，或者避免因加的酶量太多而导致质粒DNA出现smear现象。祝一切顺利。
赞一下 回复此楼
5楼2012-10-15 21:21:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答

gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议你把pET15b质粒也跑个电泳看一下，是不是质粒的问题！
赞一下 回复此楼
持之以恒、永不放弃！
2楼2012-10-15 18:09:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ysn5048

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-10-15 18:09:38
建议你把pET15b质粒也跑个电泳看一下，是不是质粒的问题！

这是我在酶切之前跑的质粒图，同样是15k的marker右边第一条是pET15b，另外两个是两条目的片段连接T载体的质粒

ysn20121015提取质粒pet15b，T-t①，T-h⒄.jpg
赞一下 回复此楼
有时候，一句话，可以改变未来
3楼2012-10-15 18:35:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

水寒冰006

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉你要酶切的东西都已经降解了，体系用的水是不是有污染，但是一般来说质粒还是蛮稳定的，还有就是用的两个酶的buffer是不是共有的可以看一下。
赞一下 回复此楼
4楼2012-10-15 21:14:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[有机交流] OpenAI又攻克数学难题了，离AI做有机合成还有多远？ +8 wangyl_123 2026-10-10 12/600 2026-10-13 20:40 by Merryya
[硕博家园] 极限拉扯，如何抉择 +9 Isak0320 2026-10-12 13/650 2026-10-13 11:57 by Isak0320
[教师之家] 课题组会帮你通过考核么？ +4 好运来～9527 2026-10-10 7/350 2026-10-13 08:41 by xli1984
[基金申请] 入职后第一次管课题组的专利缴费，对账才发现官费比别人多掏了一倍 +6 13108017953 2026-10-08 6/300 2026-10-12 20:07 by w3w3y3
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 9/450 2026-10-11 22:34 by XQNyDCa1Tk5n
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 22:26 by XQNyDCa1Tk5n
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 22:26 by XQNyDCa1Tk5n
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 9/450 2026-10-11 22:15 by XQNyDCa1Tk5n
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 22:11 by XQNyDCa1Tk5n
[教师之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 (EPI+-1)(金币-50) +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 22:06 by XQNyDCa1Tk5n
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 (EPI+-1)(金币-50) +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 14:25 by VOMexwnDzOFZ
[教师之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 (EPI+-1)(金币-50) +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 14:05 by VOMexwnDzOFZ
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 13:51 by VOMexwnDzOFZ
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 13:45 by VOMexwnDzOFZ
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 10:54 by VOMexwnDzOFZ
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 10:34 by VOMexwnDzOFZ
[考博] 招收博士生一名 +3 mandolin 2026-10-10 3/150 2026-10-11 10:21 by 不是山谷！
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 4/200 2026-10-11 03:14 by M0zrYVSAnxpE
[有机交流] 各位大佬，路线设计求助 +6 zapen 2026-10-08 8/400 2026-10-10 15:59 by zapen
[有机交流] 我应该选哪条合成路线让实验成功率高一些？ +5 jing816y 2026-10-08 9/450 2026-10-10 09:05 by zapen
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭