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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做双酶切 跑胶后什么都没有 是怎么回事？
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静音0108

银虫 (初入文坛)

[求助] 做双酶切 跑胶后什么都没有 是怎么回事？

众位虫子们  帮帮忙啊  谁遇到过这种状况  
质粒和DNA片段做双酶切后  跑胶后什么都没有  一片空白。用于酶切的质粒和片段在酶切前跑胶是有条带的 ，为何切后什么都没了？我37℃酶切了7小时，即使是时间过长了 ，也应该有弥散的吧？
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1楼 2012-09-18 21:12:24
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
静音0108: 金币+1 2012-11-10 18:42:00
你电泳时有没有酶切的质粒或DNA对照吗？不会是没加EB吧？
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2楼2012-09-18 21:57:10
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尚慕寒

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
静音0108: 金币+1 2012-11-10 18:42:13
没带MARKER？完全空白估计是忘记加EB了吧
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高山仰止，景行行止，虽不能至，心向往之。
3楼2012-09-18 23:13:02
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无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
静音0108: 金币+1 2012-11-10 18:42:27
你用MARKER，酶切前后产物，一起跑一下。7个小时感觉时间太长了，酶的活性很高，3个小时感觉就可以了
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4楼2012-09-18 23:48:57
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bclz

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-19 15:00:58
静音0108: 金币+1 2012-11-10 18:42:36
质粒和DNA的质量怎样？如果没问题的话，那就是胶或者跑电泳的问题，点样漏了或者是缓冲液用的时间太久了，或者就像楼上所说，没加EB或者EB失效了。另外，酶切7小时是有点长，我们一般三小时就OK了。
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5楼2012-09-19 10:39:26
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skuy1223

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-09-21 14:17:13
静音0108: 金币+1 2012-11-10 18:42:43
个人感觉楼主可以从以下几个方面来判断一下：第一是看溴酚蓝是否跑走了，如果跑走了，应该电泳缓冲液就没有问题；第二是加大一下上样量，有时候酶切过后的条带比未酶切的条带要弱（我也碰到这样的问题，不清楚为什么）；第三是如楼上所说，点上未经酶切的质粒和片段作为对照。如果还是跑不出来，建议楼主用自己的引物以酶切产物为模板做下PCR，看是否是因为片段降解的问题。希望能帮到你！
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努力！
6楼2012-09-19 16:11:48
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静音0108

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-09-18 21:57:10
你电泳时有没有酶切的质粒或DNA对照吗？不会是没加EB吧？

同一块胶上另一半跑的pcr产物都有带 ，就只是酶切的没有条带
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7楼2012-09-20 15:55:38
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静音0108

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 尚慕寒 at 2012-09-18 23:13:02
没带MARKER？完全空白估计是忘记加EB了吧

marker有的，EB加了
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8楼2012-09-20 15:56:10
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静音0108

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 无疆@行者 at 2012-09-18 23:48:57
你用MARKER，酶切前后产物，一起跑一下。7个小时感觉时间太长了，酶的活性很高，3个小时感觉就可以了

我第二天切了两个小时，依然什么也没有，主要是我那是个混合酶切位点，时间短了 ，怕是切不开
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9楼2012-09-20 15:57:22
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静音0108

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by bclz at 2012-09-19 10:39:26
质粒和DNA的质量怎样？如果没问题的话，那就是胶或者跑电泳的问题，点样漏了或者是缓冲液用的时间太久了，或者就像楼上所说，没加EB或者EB失效了。另外，酶切7小时是有点长，我们一般三小时就OK了。

质粒和DNA的片段都取2ul上过样了的，有条带，DNA片段的虽然较浅，看还是能看清的。胶上另一半跑的其它东西有条带，一连5个孔都漏了的可能性也不大吧 毕竟同一块胶上另一半的没有漏。
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10楼2012-09-20 16:00:45
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