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寂寞强强铜虫 (正式写手)
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提质粒遇到问题
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今天用试剂盒提取质粒，结果上午提质粒后用3ul样品+1ulbuffer跑胶6组都能发现质粒，我们组的最清晰（第一张图的marker左边第二条带），下午酶切（大概2-2.5h）后把载体的酶切产物（100ul体系+20ul 6*buffer）跑胶结果都没有发现质粒的条带。大家说说是怎么回事呢？难道是Buffer加多了，还是酶切出问题了？ 还有，昨天提质粒的时候，一格marker一格质粒，我们组跑胶时间比较长，质粒那条带在迁移过程中有一些不明显的条带在10000bp的地方有个模糊的条带，这个可能是什么？怎么会有这个东西   |
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2楼2011-08-26 21:33:46
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3楼2011-08-26 21:54:16
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4楼2011-08-26 21:55:21
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5楼2011-08-26 23:21:34
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6楼2011-08-26 23:23:58
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7楼2011-08-26 23:26:07
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lstt09nk(金币+5): 热心的娃 2011-08-27 10:42:21
lstt09nk(金币+5): 热心的娃 2011-08-27 10:42:21
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3微升电泳条带才那么窄那么暗，说明你的质粒浓度低，酶切的时候是要加缓冲液和水的，如果质粒加得少，就很容易被稀释了。看你的图片，胶孔应该是小的，看你的胶，直觉应该不是薄的，那么你的一个胶孔大概能上10微升，你酶切的时候用100微升的体系，那么要保证能看的到条带，你切质粒30微升比较保险，你是切多少微升的？酶切体系没必要那么大，20微升体系就行了，过多了就把质粒稀释了，还浪费酶。 你的ladder很诡异，为什么在靠近胶孔的地方有一条带？是不是ladder脏了导致跑的速度不均一？ 第二张图，是不是前面几个胶孔上的样品没有提取得到质粒？看起来是有RNA的，说明细胞已经破碎了，是不是手工提取的？第一张图中没有RNA，可以对比一下。至于那个模糊的带，是有点像基因组的DNA，也像质粒的复制中间体。 |
8楼2011-08-26 23:53:06
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【答案】应助回帖
寂寞强强(金币+1): 很感谢啊，那么热心，回答的很详细 2011-08-27 07:51:02
lstt09nk(BioEPI+1): 2011-08-27 10:43:14
lstt09nk(BioEPI+1): 2011-08-27 10:43:14
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分析： 1.TOP10菌株中的质粒应是高拷贝，质粒多。3ml菌液用于提取质粒即可。过夜摇菌时间不要超过12小时为宜，不然菌株老化，影响质粒提取。 2.最后一步加水洗脱，可加入50℃预热的无菌水30ul洗过柱子，也可少量多次洗脱（如：15ul,洗脱两次），这样能提高洗脱效率。 3.成功提取的质粒，电泳检查常出现3条条带，为质粒的3种形态，环状质粒电泳速度最快，开环的最慢，属于正常现象。 4.个人质粒酶切常用50ul体系,30ul质粒，加上内切酶和buffer,双酶切时注意是否具有共用buffer，是否需要加入BSA，两个酶最适酶切温度是否均为37℃（有些酶最适30℃）。 5.100ul酶切体系太大，浪费试剂的同时，更影响下不的切胶回收，胶块越大，切胶回收效率越低 6.当质粒或DNA浓度较低时，电泳时间不能太长，展开距离，离点样孔最好不要超过2cm，否定常常看不到目的条带。 个人认为，问题出现在上游的质粒提取部分，可重新摇菌提取质粒（注意操作）。 祝你成功！ |
9楼2011-08-27 00:25:11
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