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寂寞强强

铜虫 (正式写手)

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[求助] 提质粒遇到问题

今天用试剂盒提取质粒，结果上午提质粒后用3ul样品+1ulbuffer跑胶6组都能发现质粒，我们组的最清晰（第一张图的marker左边第二条带），下午酶切（大概2-2.5h）后把载体的酶切产物（100ul体系+20ul 6*buffer）跑胶结果都没有发现质粒的条带。大家说说是怎么回事呢？难道是Buffer加多了，还是酶切出问题了？

还有，昨天提质粒的时候，一格marker一格质粒，我们组跑胶时间比较长，质粒那条带在迁移过程中有一些不明显的条带在10000bp的地方有个模糊的条带，这个可能是什么？怎么会有这个东西

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Stayhungry，stayfoolish……

1楼 2011-08-26 20:02:15

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cexoihtydx

金虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

寂寞强强(金币+1): 很感谢啊，那么热心，回答的很详细 2011-08-27 07:51:02
lstt09nk(BioEPI+1): 2011-08-27 10:43:14

分析：
1.TOP10菌株中的质粒应是高拷贝，质粒多。3ml菌液用于提取质粒即可。过夜摇菌时间不要超过12小时为宜，不然菌株老化，影响质粒提取。
2.最后一步加水洗脱，可加入50℃预热的无菌水30ul洗过柱子，也可少量多次洗脱（如：15ul,洗脱两次），这样能提高洗脱效率。
3.成功提取的质粒，电泳检查常出现3条条带，为质粒的3种形态，环状质粒电泳速度最快，开环的最慢，属于正常现象。
4.个人质粒酶切常用50ul体系,30ul质粒，加上内切酶和buffer,双酶切时注意是否具有共用buffer，是否需要加入BSA，两个酶最适酶切温度是否均为37℃（有些酶最适30℃）。
5.100ul酶切体系太大，浪费试剂的同时，更影响下不的切胶回收，胶块越大，切胶回收效率越低
6.当质粒或DNA浓度较低时，电泳时间不能太长，展开距离，离点样孔最好不要超过2cm，否定常常看不到目的条带。
个人认为，问题出现在上游的质粒提取部分，可重新摇菌提取质粒（注意操作）。
祝你成功！