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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 提质粒遇到问题
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本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看

寂寞强强

铜虫 (正式写手)

[求助] 提质粒遇到问题

今天用试剂盒提取质粒，结果上午提质粒后用3ul样品+1ulbuffer跑胶6组都能发现质粒，我们组的最清晰（第一张图的marker左边第二条带），下午酶切（大概2-2.5h）后把载体的酶切产物（100ul体系+20ul 6*buffer）跑胶结果都没有发现质粒的条带。大家说说是怎么回事呢？难道是Buffer加多了，还是酶切出问题了？

还有，昨天提质粒的时候，一格marker一格质粒，我们组跑胶时间比较长，质粒那条带在迁移过程中有一些不明显的条带在10000bp的地方有个模糊的条带，这个可能是什么？怎么会有这个东西
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Stayhungry，stayfoolish……
1楼 2011-08-26 20:02:15
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cexoihtydx

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

楼主介绍的太模糊了！请提供以下信息：
1 质粒大小
2 单酶切 or 双酶切？
3 酶切目的片段大小？
4 电泳图中mark大小？
5 最后一幅图是酶切后电泳图吗？
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不放弃，日子总有阳光，追求总有希望！
2楼2011-08-26 21:33:46
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢交流 2011-08-27 10:41:51
大家说说是怎么回事呢？难道是Buffer加多了，还是酶切出问题了？
提的量少了，强行梅切，时间长了，切光了


质粒那条带在迁移过程中有一些不明显的条带在10000bp的地方有个模糊的条带，这个可能是什么？
可能是基因组DNA
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真相是最大的奢侈品
3楼2011-08-26 21:54:16
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根

【答案】应助回帖

或者那个条带是开环的质粒，他比环状的要慢
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真相是最大的奢侈品
4楼2011-08-26 21:55:21
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寂寞强强

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
1楼: Originally posted by 寂寞强强 at 2011-08-26 20:02:15:
今天用试剂盒提取质粒，结果上午提质粒后用3ul样品+1ulbuffer跑胶6组都能发现质粒，我们组的最清晰（第一张图的marker左边第二条带），下午酶切（大概2-2.5h）后把载体的酶切产物（100ul体系+20ul 6*buffer）跑胶 ...

我们用的是Top10菌株，质粒大小在5000bp左右。用的双酶切，要切下来一个大概26bp的片段，这个肯定跑胶就没有了，剩下的开环部分跑胶之后要回收，这部分将近5000bp，不应该找不到啊。第二张图的Marker清楚一些，从上到下分别是12000、10000、7500、5000。最后一张图是昨天提质粒的图，今天提质粒没有观察到结果，调了分辨率和亮度也找不到
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Stayhungry，stayfoolish……
5楼2011-08-26 23:21:34
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寂寞强强

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cexoihtydx at 2011-08-26 21:33:46:
楼主介绍的太模糊了！请提供以下信息：
1 质粒大小
2 单酶切 or 双酶切？
3 酶切目的片段大小？
4 电泳图中mark大小？
5 最后一幅图是酶切后电泳图吗？

这张图是我们跑胶后的照片，只有PCR产物的条带，是DNA的，大概在649bp左右。没有找到质粒的条带
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Stayhungry，stayfoolish……
6楼2011-08-26 23:23:58
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寂寞强强

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wanhscn at 2011-08-26 21:54:16:
大家说说是怎么回事呢？难道是Buffer加多了，还是酶切出问题了？
提的量少了，强行梅切，时间长了，切光了


质粒那条带在迁移过程中有一些不明显的条带在10000bp的地方有个模糊的条带，这个可能是什么？
可 ...

质粒双酶切后，一个26bp的肯定跑丢了，还有一个将近5000bp的开环部分，需要跑胶之后回收，但是没有找到，跑胶的时间大概有20分钟，应该够了吧
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Stayhungry，stayfoolish……
7楼2011-08-26 23:26:07
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+5): 热心的娃 2011-08-27 10:42:21
3微升电泳条带才那么窄那么暗，说明你的质粒浓度低，酶切的时候是要加缓冲液和水的，如果质粒加得少，就很容易被稀释了。看你的图片，胶孔应该是小的，看你的胶，直觉应该不是薄的，那么你的一个胶孔大概能上10微升，你酶切的时候用100微升的体系，那么要保证能看的到条带，你切质粒30微升比较保险，你是切多少微升的？酶切体系没必要那么大，20微升体系就行了，过多了就把质粒稀释了，还浪费酶。

你的ladder很诡异，为什么在靠近胶孔的地方有一条带？是不是ladder脏了导致跑的速度不均一？

第二张图，是不是前面几个胶孔上的样品没有提取得到质粒？看起来是有RNA的，说明细胞已经破碎了，是不是手工提取的？第一张图中没有RNA，可以对比一下。至于那个模糊的带，是有点像基因组的DNA，也像质粒的复制中间体。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
8楼2011-08-26 23:53:06
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cexoihtydx

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

寂寞强强(金币+1): 很感谢啊，那么热心，回答的很详细 2011-08-27 07:51:02
lstt09nk(BioEPI+1): 2011-08-27 10:43:14
分析：
1.TOP10菌株中的质粒应是高拷贝，质粒多。3ml菌液用于提取质粒即可。过夜摇菌时间不要超过12小时为宜，不然菌株老化，影响质粒提取。
2.最后一步加水洗脱，可加入50℃预热的无菌水30ul洗过柱子，也可少量多次洗脱（如：15ul,洗脱两次），这样能提高洗脱效率。
3.成功提取的质粒，电泳检查常出现3条条带，为质粒的3种形态，环状质粒电泳速度最快，开环的最慢，属于正常现象。
4.个人质粒酶切常用50ul体系,30ul质粒，加上内切酶和buffer,双酶切时注意是否具有共用buffer，是否需要加入BSA，两个酶最适酶切温度是否均为37℃（有些酶最适30℃）。
5.100ul酶切体系太大，浪费试剂的同时，更影响下不的切胶回收，胶块越大，切胶回收效率越低
6.当质粒或DNA浓度较低时，电泳时间不能太长，展开距离，离点样孔最好不要超过2cm，否定常常看不到目的条带。
个人认为，问题出现在上游的质粒提取部分，可重新摇菌提取质粒（注意操作）。
祝你成功！
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不放弃，日子总有阳光，追求总有希望！
9楼2011-08-27 00:25:11
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cexoihtydx

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

核酸电泳可参考帖子：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3503978
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不放弃，日子总有阳光，追求总有希望！
10楼2011-08-27 00:31:25
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