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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】为何提不出质粒来
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chengkun

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】为何提不出质粒来 已有10人参与

各位大侠，请教个问题。我把我pcr出的基因片段纯化后，连接t载体，挑转化子后，菌落pcr有目的条带，但是提质粒后酶切，电泳发现什么都没有；同实验室的一个硕士同学也遇到类似的问题，用提出的质粒做pcr验证都有条带，但是酶切也都什么都没有，哪位高手知道原因的话，请给予指点，谢谢了。急
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1楼 2010-05-11 10:14:52
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yinsongna

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):感谢回帖交流~~ 2010-05-11 19:35:17
菌落pcr和质粒PCR鉴定假阳性多，酶切鉴定才准确，你现在切不出来的话先看看酶切条件都对不对，确定没加错，酶切时间是多少，电泳的话跟原质粒对比一下，看看是不是没切完全
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2楼2010-05-11 10:25:43
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hyw1989960

木虫 (正式写手)

快乐家族二十八
★ ★ ★
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scelab(金币+2):鼓励新虫！欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-11 19:41:40
你是质粒没提出来还是提出来了酶切不了，质粒没提出来可以加大菌液浓度，可能你提的质粒浓度太低，不足以用琼脂糖检测，用紫外分光检测一下，
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快乐家族
3楼2010-05-11 10:33:10
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chengkun

金虫 (正式写手)
我们用摇瓶摇菌，菌液浓度也挺大的，提出的质粒跑过电泳，没有带。按说t载体应该是拷贝数还可以啊？
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4楼2010-05-11 10:38:23
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chengkun

金虫 (正式写手)
我们的酶切体系没有错，没切是过夜的
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5楼2010-05-11 10:39:11
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stliimoon

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你多挑点转化子进行鉴定，我曾今也发生过这种情况的，多挑点就好了
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6楼2010-05-11 10:53:34
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★
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scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-11 19:41:57
你现在的现象，我想已经很明确了，就是质粒没有提出来，增大菌液用量，5ml试试。

另外问一下你用的是EcoRI酶切吗？怎么这么长时间？
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7楼2010-05-11 11:42:25
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
有的酶切时间长了就会把质粒切碎的！
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8楼2010-05-11 13:03:16
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-11 19:42:04
楼上的MM说的吓死人，一般不会的，正规品牌的酶，一般都经过24小时酶切验证的，但是酶切的结果才是最为可信的，PCR很容易是假的～
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9楼2010-05-11 13:50:16
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chengkun

金虫 (正式写手)
我用的酶切位点是BamHI和HindIII，是宝生物的酶
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10楼2010-05-11 15:28:11
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