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chengkun

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】为何提不出质粒来 已有10人参与

各位大侠,请教个问题。我把我pcr出的基因片段纯化后,连接t载体,挑转化子后,菌落pcr有目的条带,但是提质粒后酶切,电泳发现什么都没有;同实验室的一个硕士同学也遇到类似的问题,用提出的质粒做pcr验证都有条带,但是酶切也都什么都没有,哪位高手知道原因的话,请给予指点,谢谢了。急
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yinsongna

金虫 (正式写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):感谢回帖交流~~ 2010-05-11 19:35:17
菌落pcr和质粒PCR鉴定假阳性多,酶切鉴定才准确,你现在切不出来的话先看看酶切条件都对不对,确定没加错,酶切时间是多少,电泳的话跟原质粒对比一下,看看是不是没切完全
2楼2010-05-11 10:25:43
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hyw1989960

木虫 (正式写手)

快乐家族二十八

★ ★ ★
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scelab(金币+2):鼓励新虫!欢迎多来交流!:tiger06: 2010-05-11 19:41:40
你是质粒没提出来还是提出来了酶切不了,质粒没提出来可以加大菌液浓度,可能你提的质粒浓度太低,不足以用琼脂糖检测,用紫外分光检测一下,
快乐家族
3楼2010-05-11 10:33:10
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chengkun

金虫 (正式写手)

我们用摇瓶摇菌,菌液浓度也挺大的,提出的质粒跑过电泳,没有带。按说t载体应该是拷贝数还可以啊?
4楼2010-05-11 10:38:23
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chengkun

金虫 (正式写手)

我们的酶切体系没有错,没切是过夜的
5楼2010-05-11 10:39:11
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stliimoon

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你多挑点转化子进行鉴定,我曾今也发生过这种情况的,多挑点就好了
6楼2010-05-11 10:53:34
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

★ ★
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scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-05-11 19:41:57
你现在的现象,我想已经很明确了,就是质粒没有提出来,增大菌液用量,5ml试试。

另外问一下你用的是EcoRI酶切吗?怎么这么长时间?
7楼2010-05-11 11:42:25
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)


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有的酶切时间长了就会把质粒切碎的!
8楼2010-05-11 13:03:16
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liyong1981

金虫 (正式写手)



scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-05-11 19:42:04
楼上的MM说的吓死人,一般不会的,正规品牌的酶,一般都经过24小时酶切验证的,但是酶切的结果才是最为可信的,PCR很容易是假的~
9楼2010-05-11 13:50:16
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chengkun

金虫 (正式写手)

我用的酶切位点是BamHI和HindIII,是宝生物的酶
10楼2010-05-11 15:28:11
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