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vickie20

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[求助] 提不出质粒，不知道出了什么问题，求助……

我用的大肠杆菌BM25.8提质粒，菌已经保存一年多了，我用保存的菌液划板，然后挑取单菌落接种到液体LB里摇过夜，再用这些长好的菌液提，用的是biomiga的试剂盒，按照说明书的步骤来的，操作是没什么问题，这些质粒空载体大小有3589bp，目的基因已经测序，800-1000bp，提好后跑胶，用的5000bp的Marker，提出来的东西都比5000大，这些都不是质粒吧？做了十来天了都一直都没提好，不知道出了什么问题，原来看了好多帖子，变性时间啊，温和混匀啊，这些我都小心操作了，但是都提不出来，不知道哪里出问题了，求各位帮我分析下，哪里出差错了。

附上其中一张电泳图。

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1楼 2011-08-04 15:47:08

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, MolEPI+1): 辛苦 2011-08-05 10:45:04

看电泳图，这应该是载体，楼主是想提取重组载体进行验证吧，重新进行提取吧，如果按照你的信息，提取出来的载体应该比线性化的小很多，可是出来居然在5000bp以上，最好做一个双酶切，毕竟marker只是表征线性载体的一个标准，只有将载体线性化才具有说服性；
个人建议：重新提取质粒，把胶配的好一些，你上面那张图marker都跑成那样子了，所以胶有点问题；
提取出来的载体点样的时候可以加一个空载体进行对照，因为你重组载体连接了一个基因片段，按照楼主所说的长度，那么重组载体应该比空载体大一些；
进行一个双酶切，然后点样看看，点样的时候带上你当时进行酶切的空载体和酶切的基因作为对照，如果大小一致，那么恭喜你，对了；

加油！祝实验顺利！