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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 提不出质粒，不知道出了什么问题，求助……
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vickie20

铜虫 (小有名气)

[求助] 提不出质粒，不知道出了什么问题，求助……

我用的大肠杆菌BM25.8提质粒，菌已经保存一年多了，我用保存的菌液划板，然后挑取单菌落接种到液体LB里摇过夜，再用这些长好的菌液提，用的是biomiga的试剂盒，按照说明书的步骤来的，操作是没什么问题，这些质粒空载体大小有3589bp，目的基因已经测序，800-1000bp，提好后跑胶，用的5000bp的Marker，提出来的东西都比5000大，这些都不是质粒吧？做了十来天了都一直都没提好，不知道出了什么问题，原来看了好多帖子，变性时间啊，温和混匀啊，这些我都小心操作了，但是都提不出来，不知道哪里出问题了，求各位帮我分析下，哪里出差错了。附上其中一张电泳图。
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1楼 2011-08-04 15:47:08
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, MolEPI+1): 辛苦 2011-08-05 10:45:04
看电泳图，这应该是载体，楼主是想提取重组载体进行验证吧，重新进行提取吧，如果按照你的信息，提取出来的载体应该比线性化的小很多，可是出来居然在5000bp以上，最好做一个双酶切，毕竟marker只是表征线性载体的一个标准，只有将载体线性化才具有说服性；
个人建议：重新提取质粒，把胶配的好一些，你上面那张图marker都跑成那样子了，所以胶有点问题；
                提取出来的载体点样的时候可以加一个空载体进行对照，因为你重组载体连接了一个基因片段，按照楼主所说的长度，那么重组载体应该比空载体大一些；
                进行一个双酶切，然后点样看看，点样的时候带上你当时进行酶切的空载体和酶切的基因作为对照，如果大小一致，那么恭喜你，对了；

加油！祝实验顺利！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
12楼2011-08-05 10:21:41
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普通回帖

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-04 16:36:24
vickie20(金币+5): 2011-08-04 17:11:53
有可能是质粒的，电泳没跑好，Maker都有弥散了，因为质粒是环状，比线状跑得慢，所以偏大是正常的。
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Thank-you，so-blue.
2楼2011-08-04 16:06:22
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vickie20

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by susizheng at 2011-08-04 16:06:22:
有可能是质粒的，电泳没跑好，Maker都有弥散了，因为质粒是环状，比线状跑得慢，所以偏大是正常的。

不是说线性的最慢其他结构的快吗？一般来说不是有两条到三条带吗？我这个貌似每个泳道都只有一条
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3楼2011-08-04 17:05:12
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
引用回帖:
3楼: Originally posted by vickie20 at 2011-08-04 17:05:12:
不是说线性的最慢其他结构的快吗？一般来说不是有两条到三条带吗？我这个貌似每个泳道都只有一条

不好意思，口误了，环状是跑得比线状快，应该是有可能是复制中间体，及开环的形式曾在，跑得比线状慢。
建议可以找个合适的酶切位点酶切后和未酶切的质粒作个对照跑电泳，再看看。
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Thank-you，so-blue.
4楼2011-08-04 17:27:53
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longage.gene

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by susizheng at 2011-08-04 16:06:22:
有可能是质粒的，电泳没跑好，Maker都有弥散了，因为质粒是环状，比线状跑得慢，所以偏大是正常的。

一般来说环状更快！
楼主最好酶切试试看。楼主是含有质粒的菌保存了一年？你确定保存时没错？保存后check了没？
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5楼2011-08-04 17:28:52
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vickie20

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by longage.gene at 2011-08-04 17:28:52:
一般来说环状更快！
楼主最好酶切试试看。楼主是含有质粒的菌保存了一年？你确定保存时没错？保存后check了没？

那菌不是我保存的，是师姐保存的，已经毕业走了，她已经走了我才来的，所以我现在只能跟她扣扣联系，问一些情况，可是一直都没有回应……
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6楼2011-08-04 17:39:35
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
有两个泳道里能看到条带，把这两个质粒酶切验证一下
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
7楼2011-08-04 18:47:35
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vickie20

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-04 18:47:35:
有两个泳道里能看到条带，把这两个质粒酶切验证一下

嗯，我试试
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8楼2011-08-04 18:52:54
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
还有你竟然拿mark来标定质粒的大小，这是完全错误的。mark只能标定线性DNA的大小！
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9楼2011-08-04 19:03:39
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vickie20

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-04 19:03:39:
还有你竟然拿mark来标定质粒的大小，这是完全错误的。mark只能标定线性DNA的大小！

但是超螺旋啊开环啊的位置都应该在线性的下面吧？也就是说应该是在目的位置的下面吧？
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10楼2011-08-04 19:34:45
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