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ssdy_5366228

木虫 (小有名气)

[求助] 求助关于质粒提取的若干问题，谢谢了！！

求教各位师兄姐同仁，小弟提取野生型大肠杆菌（临床菌）的质粒，有若干问题：
1.野生型大肠杆菌R质粒是松弛性？还是严紧型？我查过资料，说是低拷贝严紧型，不知道正确与否。
2.用LB液体培养基培养细菌，用不用加抗生素？很多文献说加Amp，但我所提质粒携带喹诺酮类耐药基因，加Amp有作用吗？是不是应该加喹诺酮类抗生素呢？
3.如果要加抗生素，终浓度应该是多少呢？经查资料，严紧型与松弛性质粒的工作终浓度不一样，后者明显大于前者。
有过经验的师兄姐同仁，望不吝赐教！小弟感激不尽，在此郑重谢过！！
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1楼 2011-07-20 20:32:54
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dailei1983

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
ssdy_5366228(金币+20): 谢谢你！ 2011-07-23 11:57:57
qinhy(金币+1): 谢谢应助回帖~ 2011-07-24 09:26:53
1. 野生型大肠杆菌一般都含有很多个质粒，分子量有大有小，小的2-3kb，大的200-300kb，所以类型是不一样的，拷贝数和严谨性自然有高有低。
2.如果你的野生菌株不对任何药物耐药，你培养的时候肯定不能加任何抗生素。但如果你提的是携带氟喹诺酮耐药基因质粒的菌株，应该加入氟喹诺酮类药物，如环丙沙星等，不能加Amp。
3.加环丙沙星的话，只要加到终浓度等于该菌对环丙的耐药界限值就可以了。不要太高，否则可能会影响你菌的生长。比如大肠杆菌，加到4μg/ml就足够了。
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2楼2011-07-23 06:18:47
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ssdy_5366228

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by dailei1983 at 2011-07-23 06:18:47:
1. 野生型大肠杆菌一般都含有很多个质粒，分子量有大有小，小的2-3kb，大的200-300kb，所以类型是不一样的，拷贝数和严谨性自然有高有低。
2.如果你的野生菌株不对任何药物耐药，你培养的时候肯定不能加任何抗生 ...

同学你好，野生型R质粒应该不会种类很多吧？我做了对照实验，一个空白，一个加了Amp，一个加了环丙沙星，药浓均为50ug/ml，3管LB同时培养一株菌的单克隆，提质粒后电泳观察条带差不多，没有显示出加了抗生素，条带更亮（质粒质量数量更优）。请问你有什么好的建议？谢谢！
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3楼2011-07-23 12:05:52
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kenhtsjj

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

ssdy_5366228(金币+10): 谢谢你 2011-07-27 01:58:57
同学你好，当我们在实验室提取克隆菌事需要加入氨苄，是因为我们在人工载体上面导入了目的片段后才显示其抗药性，因此，我认为加入抗生素的目的在于筛选我们的阳性菌落，不让杂菌生长，以期得到我们的目的克隆。而你的三组对照试验，既然三组都能提取出质粒，表明你的菌生长情况一样，也就是说应该对这两种抗生素都有耐药性，所以我认为你的三个组在提取质粒后不能表现出区别是正常情况。
如果你希望提取质粒比较多，条带比较亮，可以试试第一步多加一点菌液，最后一步的buffer少加一些这样来提高质粒浓度。
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4楼2011-07-24 16:51:20
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dailei1983

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
karl2100(金币+1): 谢谢发言！ 2011-07-31 01:11:08
引用回帖:
Originally posted by ssdy_5366228 at 2011-07-23 12:05:52:
同学你好，野生型R质粒应该不会种类很多吧？我做了对照实验，一个空白，一个加了Amp，一个加了环丙沙星，药浓均为50ug/ml，3管LB同时培养一株菌的单克隆，提质粒后电泳观察条带差不多，没有显示出加了抗生素， ...

你好，野生菌株背景来源不同，有时甚至相同的情况下都可能含有许多大小不同的质粒。如果你要提野生质粒，建议最好用中提或大提的方法，这样才能把那些分子量大，而且拷贝数低的质粒提出来。我们实验室之前提的时候，一株菌含上十个质粒很正常。你所加的抗生素只可能对含有你那种抗生素耐药基因的质粒有一定的促进作用，对其他的质粒应该用处不大。所以就看你试验的目的，如果只想提含某种耐药基因的那一个质粒，就加特定抗生素培养；如果想把某株菌的所有质粒都提出来，那么不加抗生素培养也没问题，加也无妨。
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5楼2011-07-27 04:03:00
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ssdy_5366228

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by dailei1983 at 2011-07-27 04:03:00:
你好，野生菌株背景来源不同，有时甚至相同的情况下都可能含有许多大小不同的质粒。如果你要提野生质粒，建议最好用中提或大提的方法，这样才能把那些分子量大，而且拷贝数低的质粒提出来。我们实验室之前提的 ...

你好，按你说的，我做的对照试验是不是就没用啊？虽然电泳条带差不多，但并不能说明加抗生素与不加抗生素效果相同，加了抗生素含耐药基因的质粒就很多，不加抗生素各种质粒都有，条带亮度与前者差不多，是不是这样呢？
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6楼2011-07-31 00:21:53
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