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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 郁闷啊，提不出质粒！
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b529941390

木虫 (正式写手)

[交流] 郁闷啊，提不出质粒！ 已有7人参与

用的是pTRC 6His的质粒载体，需要提取质粒测序，老是提取不出来，郁闷啊，更不爽的是，在做菌落PCR和质粒PCR的时候，阴性对照也有了条带！
做生物的东西怎么这么麻烦呢，好像去做化学啊！
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不离不弃不易不移
1楼 2011-07-07 15:32:41
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
提质粒...这个~~楼主有分析过是什么原因吗？摇菌、提取、检测等等步骤都有可能出问题哦...其实提质粒还蛮简单的，至少比提RNA容易多了。
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2楼2011-07-07 16:03:53
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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)
★
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生物和化学  自然科学里面最悲剧的两个专业~~~~~~~~
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3楼2011-07-07 16:31:33
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b529941390

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by holyala at 2011-07-07 16:03:53:
提质粒...这个~~楼主有分析过是什么原因吗？摇菌、提取、检测等等步骤都有可能出问题哦...其实提质粒还蛮简单的，至少比提RNA容易多了。

提取过程用的是kit
然后菌是从-80度跳出来的，在LB A+的培养基中的，然后20mL提取质粒，1uL电泳竟然都看不到条带！  后来试了下8uL电泳，可以看到很弱的质粒条带
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不离不弃不易不移
4楼2011-07-07 17:06:53
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yesucao

木虫 (正式写手)
★
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个人建议，如果你要用于测序的话最好是试剂盒提取质粒，手提的话毕竟有限，有的时候达不到测序要求，不过也看你送去测序公司有哪些要求，可以让他们给你发一份看看。
我们实验室都是用摇好的菌液送去测序的，EP管装着，1-2ml就行了，常温运输就可以，测序公司会再活化一下，提质粒，测序。
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5楼2011-07-07 20:34:25
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yguang

木虫 (职业作家)
★
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提质粒是分子生物学中最简单最基本的工作，这一关过不了可不行！貌似楼主是接着别人的工作做的，你确定你用的菌里有这个质粒吗，还是先验证一下吧，不要太相信前人的工作。问问用过这个菌和质粒的师兄师姐是怎么回事。还有就是，不要被一些小挫折吓到，如果楼主仅仅是发发牢骚那就发，如果楼主表达的是真实想法，那趁早换专业去吧，因为你以后会遇到比这个麻烦无数倍的事，我做了15年分子生物学，现在实验中还经常遇到一些奇怪的事呢！
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6楼2011-07-07 21:41:23
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三尺百度豆豆

新虫 (初入文坛)
★
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提质粒真是很简单的，比化学好玩。8ul是有微弱条带，就说明是提出来了，继续加油……
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豆豆在哪里，我在找你
7楼2011-07-08 00:10:53
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
★
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可以选择用试剂盒提取，如果用试剂盒提取不出来，可能是你的菌有问题了。
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8楼2011-07-08 11:03:45
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by b529941390 at 2011-07-07 17:06:53:
提取过程用的是kit
然后菌是从-80度跳出来的，在LB A+的培养基中的，然后20mL提取质粒，1uL电泳竟然都看不到条带！  后来试了下8uL电泳，可以看到很弱的质粒条带

提完质粒可以测一下浓度，用 nanodrop测DNA浓度，试着多提几次就有经验了，试验需要多重复，然后熟能生巧，一切都会好起来的~~~
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9楼2011-07-08 11:06:17
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by b529941390 at 2011-07-07 17:06:53:
提取过程用的是kit
然后菌是从-80度跳出来的，在LB A+的培养基中的，然后20mL提取质粒，1uL电泳竟然都看不到条带！  后来试了下8uL电泳，可以看到很弱的质粒条带

1uL没有，8uL有，说明不是没有提出来，而是浓度太低。根据你的描述，我估计可能是摇菌的问题，你直接将菌种从-80挑出来就接种去摇，这个...不太好，菌不容易长起来。建议先将-80保存的菌种接到5mL LB培养基的试管中，37℃振荡培养6~8小时，再用这种活化的菌液去接种到三角瓶中培养过夜，然后再提质粒。
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10楼2011-07-08 11:26:57
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