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提质粒的问题
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下图是我提的两次质粒。1、2泳道提的效果很差，不知道提出来的这个条带是缺刻还是双螺旋？3、4泳道条带是明显的，但是不清楚红线圈内的条带是什么。希望大家帮我解释下。 |
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2楼2011-08-03 11:59:25
hqchlorella
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6楼2011-08-03 14:15:54
【答案】应助回帖
★ ★ ★
dhd997(金币+3): 欢迎多来交流 2011-08-09 07:18:19
liuwei78(金币+1): 2011-09-08 16:25:53
dhd997(金币+3): 欢迎多来交流 2011-08-09 07:18:19
liuwei78(金币+1): 2011-09-08 16:25:53
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质粒提出来三个条带是对的啊，线性，超螺旋，环状，三种构像的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序是超螺旋>线形>开环，线形的质粒在中间，而开环的质粒在最后。 1 从细菌中大量提取的质粒电泳时，不一定均出现三条带，有时会出现两条，甚至一条(一般是超螺旋的质粒)，这跟上样量也有些关系。出现不同的结果都是由抽提质粒时的操作手法造成的。如果严格按照操作步骤，超螺旋的质粒会较多。 2 酶切将质粒线性化以后，才可以用mark判断大小。如果有三种构像，可以用中间那条带与mark比较判断大小。 3 酶切后线性化条带电泳时所处的位置就指示质粒的大小 |
7楼2011-08-08 23:41:04
8楼2011-08-09 09:48:38
w2boluo
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【答案】应助回帖
liuwei78(金币+5): 2011-09-08 16:25:34
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楼主这个图可以说提得惨不忍睹。1，2的产量太低，带型位置也更接近于缺刻质粒；3，4的杂质含量太高。所谓的质粒3条带应该都在超螺旋质粒的上方，下方出现很淡的带，按分子克隆的说法，属于质粒在强变性条件下处理过长，变成无规则卷曲构象，电泳大小约为正常带型的一半。这种情况多见于煮沸法，碱法提取质粒在加入溶液II，也就是NaOH+SDS溶液后静置时间过长也会出现，现在的试剂盒多采用减法，加入裂解液后溶液变澄清即可马上加入中和液（溶液III），不必等待。但这种变形带型对后续实验基本无影响，也可以完全不理它。 给楼主的建议：注意一下菌体的浓度以及和抽提液的比例，3，4这样的泳道应该记下所用的原始培养基的体积，下次提取的时候减半；电泳marker不要用DL2000，差的比较远。 |
9楼2011-08-09 10:38:31
