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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 提质粒的问题
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liuwei78

铜虫 (小有名气)

[求助] 提质粒的问题

下图是我提的两次质粒。1、2泳道提的效果很差，不知道提出来的这个条带是缺刻还是双螺旋？3、4泳道条带是明显的，但是不清楚红线圈内的条带是什么。希望大家帮我解释下。
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1楼 2011-08-03 11:34:41
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★
liuwei78(金币+2): 2011-08-03 16:28:14
dhd997(金币+2): good 2011-08-09 07:17:29
不知道楼主这四个质粒是不是同一个质粒呢？
如果是的话，那1 2泳道很有可能是因为质粒量太少了而看不到底下那条带；你看看质粒的大小对不对，可以做个酶切看看质粒大小，这样保险一些；
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-08-03 11:59:25
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hqchlorella

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
liuwei78(金币+2): 2011-08-03 16:28:23
dhd997(金币+2): good 2011-08-09 07:17:39
1，2只有1条带，是超螺旋，不利于后续的酶切等实验；
3，4为3条带，表明质粒提取过程非常好，质粒的质量很高。
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风一样的汉子
3楼2011-08-03 12:11:00
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liby

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

liuwei78(金币+2): 2011-08-03 16:28:29
质粒以三种状态存在，线性，超螺旋，环状，所以三条带是对的。
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4楼2011-08-03 12:56:33
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maxiaojiaozl

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
liuwei78(金币+2): 2011-08-03 16:28:33
dhd997(金币+2): good 2011-08-09 07:17:50
四个不知道是不是一种质粒，提质粒不用maker,也是可以的，主要是有条带就证明提出来了，亮的自然是量多，而不明显是提得量少，如果是一种质粒应该会跟其中一些去蛋白的步骤有关。
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5楼2011-08-03 13:12:56
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
liuwei78(金币+5): 2011-08-03 16:25:45
dhd997(金币+2): good 2011-08-09 07:17:59
做酶切验证一下就知道了另外低拷贝质粒与高拷贝质粒跑出来的带型不一样是很正常的，即使同一种质粒，若在不同的受体细胞中，那么质粒条带都有可能不一样
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
6楼2011-08-03 14:15:54
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ytf149

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): 欢迎多来交流 2011-08-09 07:18:19
liuwei78(金币+1): 2011-09-08 16:25:53
质粒提出来三个条带是对的啊，线性，超螺旋，环状，三种构像的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序是超螺旋>线形>开环，线形的质粒在中间，而开环的质粒在最后。
1 从细菌中大量提取的质粒电泳时，不一定均出现三条带，有时会出现两条，甚至一条(一般是超螺旋的质粒)，这跟上样量也有些关系。出现不同的结果都是由抽提质粒时的操作手法造成的。如果严格按照操作步骤，超螺旋的质粒会较多。
2 酶切将质粒线性化以后，才可以用mark判断大小。如果有三种构像，可以用中间那条带与mark比较判断大小。
3 酶切后线性化条带电泳时所处的位置就指示质粒的大小
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加油~
7楼2011-08-08 23:41:04
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wzqno

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

liuwei78(金币+1): 2011-09-08 16:25:48
抽屉质粒电泳的时候有三条带，分别是超螺旋质粒（最快，完整的），线性质粒（完全被打断的那种）还有开环质粒（只有一条链被打断）。如果第三四条没有经过酶切的话，那只能认为提质粒的时候，不小心掺入了基因组片段了
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8楼2011-08-09 09:48:38
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w2boluo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

liuwei78(金币+5): 2011-09-08 16:25:34
楼主这个图可以说提得惨不忍睹。1，2的产量太低，带型位置也更接近于缺刻质粒；3，4的杂质含量太高。所谓的质粒3条带应该都在超螺旋质粒的上方，下方出现很淡的带，按分子克隆的说法，属于质粒在强变性条件下处理过长，变成无规则卷曲构象，电泳大小约为正常带型的一半。这种情况多见于煮沸法，碱法提取质粒在加入溶液II，也就是NaOH+SDS溶液后静置时间过长也会出现，现在的试剂盒多采用减法，加入裂解液后溶液变澄清即可马上加入中和液（溶液III），不必等待。但这种变形带型对后续实验基本无影响，也可以完全不理它。
给楼主的建议：注意一下菌体的浓度以及和抽提液的比例，3，4这样的泳道应该记下所用的原始培养基的体积，下次提取的时候减半；电泳marker不要用DL2000，差的比较远。
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How about the future？
9楼2011-08-09 10:38:31
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