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caojinxuan

银虫 (正式写手)

[求助] 请教大家一个问题--提质粒

我将保存在BL21中的质粒进行培养提质粒，具体操作是将100ul甘油菌加入5mlLB培养基中，同时加入卡那霉素（30ug/ml），摇床培养，可是都快2天了，培养基依旧是澄清的，请问这是什么原因啊？

[ Last edited by 1949stone on 2011-5-24 at 15:41 ]
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1楼 2011-05-24 12:31:12
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lly198784

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-05-24 21:09:40
你保种的甘油管多久了？还有是放在多少温度下的，是保的菌液吗？一般出现这种情况主要是菌种保存时间过长，直接接试管很难活化出来，所以建议你先划线平板，长出来的单菌落接试管，这样应该就没有问题了，我都是这样做的。
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2楼2011-05-24 12:35:28
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by caojinxuan at 2011-05-24 12:31:12:
我将保存在BL21中的质粒进行培养提质粒，具体操作是将100ul甘油菌加入5mlLB培养基中，同时加入卡那霉素（30ug/ml），摇床培养，可是都快2天了，培养基依旧是澄清的，请问这是什么原因啊？

一般是先要划平板的，然后再跳单菌落在LB培养基大概200rpm 37℃培养，多摇几管，另外加卡那霉素的量是1mL培养基加1ul卡那霉素，5mL LB培养基应该加5uLkanamycin，也不要加多了。
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3楼2011-05-24 14:28:22
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疯狂修行者

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
caojinxuan(金币+1): 谢谢 2011-05-24 17:21:40
amisking(金币+2, EPI+1): 鼓励应助 2011-05-24 21:09:49
caojinxuan(金币+1): 谢谢 2011-11-17 09:55:09
引用回帖:
Originally posted by caojinxuan at 2011-05-24 12:31:12:
我将保存在BL21中的质粒进行培养提质粒，具体操作是将100ul甘油菌加入5mlLB培养基中，同时加入卡那霉素（30ug/ml），摇床培养，可是都快2天了，培养基依旧是澄清的，请问这是什么原因啊？

应该是菌株保存的问题，你想办法把菌株活化起来。
   菌株保存出问题的可能原因有：
（1）保存时菌株活化不充分，菌株量少
（2）保存菌株时，甘油量太少，菌株冻死了
（3）保存问题不对，菌株又在生长，死菌较多
    由于菌株保存不当引起菌株量少，那现在活化就要用非常办法了。
（1）扩大接种量，多接些甘油菌，转速放大，温度30，看能不能活化起来
（2）不加抗生素先培养，把菌先活化起来，当然也可以放大接种量，等活化起来后，在转接到有抗生素的培养基中
（3）先用固体培养基培养，在转接到液体培养基中，固体中开始也可以不加抗生素，等长出菌落后在利用抗生素筛选。
（4）在不行，就只能重新搞了
    “东西是活的，人是死的”,想想办法嘛，嘿嘿！
    祝你实验成功！！
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戒骄戒躁，坦荡做人，平常心做事，享受生活之美！！
4楼2011-05-24 14:40:22
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caojinxuan

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lly198784 at 2011-05-24 12:35:28:
你保种的甘油管多久了？还有是放在多少温度下的，是保的菌液吗？一般出现这种情况主要是菌种保存时间过长，直接接试管很难活化出来，所以建议你先划线平板，长出来的单菌落接试管，这样应该就没有问题了，我都是这 ...

保存大概5个月，放在-20保存的，保的是菌液，由于保存的较少，甘油菌液已经用完，那我可以从现在培养的菌液中取出部分划线培养吗？
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累事经年，仰天啸月间情感俱伤 纵马横川，剑指远峰处星河灿烂
5楼2011-05-24 17:25:47
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lly198784

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by caojinxuan at 2011-05-24 17:25:47:
保存大概5个月，放在-20保存的，保的是菌液，由于保存的较少，甘油菌液已经用完，那我可以从现在培养的菌液中取出部分划线培养吗？

可以用现在的菌液划线或者涂布，如果很稀，可以浓缩之后再划线。-20度保存五个月是不太好的，一般放在-80度冰箱就会活力下降的，而且建议你以后保种可以加大浓度。
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6楼2011-05-25 15:11:17
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wuzuobin125

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你的菌应该是活力不行了，如果还有菌种的话还是先划线培养再筛选了，我觉得保存甘油菌最好还是在负70度，这样时间上可以长一些，活力也没下降。要是想在负20保存的话，可以试一下穿刺培养保存，但时间还是不要放太长了。
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7楼2011-05-25 16:24:47
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mxlo.o
8楼2012-03-02 19:15:45
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
285853楼: Originally posted by wuzuobin125 at 2011-05-25 16:24:47
你的菌应该是活力不行了，如果还有菌种的话还是先划线培养再筛选了，我觉得保存甘油菌最好还是在负70度，这样时间上可以长一些，活力也没下降。要是想在负20保存的话，可以试一下穿刺培养保存，但时间还是不要放太长 ...

穿刺菌不是应该在4°保存吗？在-20可以吗？菌不会被冻死吗？！
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9楼2012-08-28 18:58:06
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