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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 提质粒遇到问题
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★
lstt09nk(金币+3): 感谢参与 2011-08-27 10:42:41
引用回帖:
9楼: Originally posted by cexoihtydx at 2011-08-27 00:25:11:
分析：
1.TOP10菌株中的质粒应是高拷贝，质粒多。3ml菌液用于提取质粒即可。过夜摇菌时间不要超过12小时为宜，不然菌株老化，影响质粒提取。
2.最后一步加水洗脱，可加入50℃预热的无菌水30ul洗过柱子，也可少量 ...

对于1：如果接种量少，则需要摇较久，12小时不一定足够，我喜欢用OD1.5以上，提质粒没有问题。

对于2：“少量多次”这个做法在说明书上有，而且用的不是你说的水，而是用试剂盒提供的洗脱液。

对于5：假如要双酶切回收大片段质粒，我认为可以用100微升，因为可以使用特制梳子，长度与一般梳子一样，但是多个梳齿是并起来的一块，这样做出来的胶孔是一个长槽，可以跑超过100微升以上。这种梳子还有一个正常尺寸的梳齿，用于加DNA Ladder。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
11楼2011-08-27 02:43:43
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寂寞强强

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-08-26 23:53:06:
3微升电泳条带才那么窄那么暗，说明你的质粒浓度低，酶切的时候是要加缓冲液和水的，如果质粒加得少，就很容易被稀释了。看你的图片，胶孔应该是小的，看你的胶，直觉应该不是薄的，那么你的一个胶孔大概能上10微 ...

嗯，加了35ul的质粒，然后2种酶歌2ul，Tango Buffer 20ul，剩下的用水配成100ul的反应体系。

Ladder那边的条带我没有注意到啊，那条带没准就是有呢，后面的第三张图也有这条带的，第二张图片的胶少了一部分，拿的时候胶孔裂开了。第二张图是回收用的，是大孔，只点了一个Marker和一个质粒，是昨天提的质粒，只有这个提出来了，今天重新提（后面的第三张图），都没有提出来……我们是用试剂盒提取的
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Stayhungry，stayfoolish……
12楼2011-08-27 08:46:09
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cato8163

银虫 (正式写手)
楼上说的很多，
楼主最少应该把胶跑好吧，胶制的实在不好。
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13楼2011-08-27 21:56:53
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寂寞强强

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by cato8163 at 2011-08-27 21:56:53:
楼上说的很多，
楼主最少应该把胶跑好吧，胶制的实在不好。

嗯，谢谢你的批评指教，这个胶是我们班同学制的，大家一起用，这块确实没制好，我们在操作细节上还有很大不足，以后一定注意
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Stayhungry，stayfoolish……
14楼2011-08-28 12:08:19
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