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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 提质粒遇到问题
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寂寞强强

铜虫 (正式写手)

[求助] 提质粒遇到问题

今天用试剂盒提取质粒，结果上午提质粒后用3ul样品+1ulbuffer跑胶6组都能发现质粒，我们组的最清晰（第一张图的marker左边第二条带），下午酶切（大概2-2.5h）后把载体的酶切产物（100ul体系+20ul 6*buffer）跑胶结果都没有发现质粒的条带。大家说说是怎么回事呢？难道是Buffer加多了，还是酶切出问题了？

还有，昨天提质粒的时候，一格marker一格质粒，我们组跑胶时间比较长，质粒那条带在迁移过程中有一些不明显的条带在10000bp的地方有个模糊的条带，这个可能是什么？怎么会有这个东西
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Stayhungry，stayfoolish……
1楼 2011-08-26 20:02:15
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+5): 热心的娃 2011-08-27 10:42:21
3微升电泳条带才那么窄那么暗，说明你的质粒浓度低，酶切的时候是要加缓冲液和水的，如果质粒加得少，就很容易被稀释了。看你的图片，胶孔应该是小的，看你的胶，直觉应该不是薄的，那么你的一个胶孔大概能上10微升，你酶切的时候用100微升的体系，那么要保证能看的到条带，你切质粒30微升比较保险，你是切多少微升的？酶切体系没必要那么大，20微升体系就行了，过多了就把质粒稀释了，还浪费酶。

你的ladder很诡异，为什么在靠近胶孔的地方有一条带？是不是ladder脏了导致跑的速度不均一？

第二张图，是不是前面几个胶孔上的样品没有提取得到质粒？看起来是有RNA的，说明细胞已经破碎了，是不是手工提取的？第一张图中没有RNA，可以对比一下。至于那个模糊的带，是有点像基因组的DNA，也像质粒的复制中间体。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
8楼2011-08-26 23:53:06
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★
lstt09nk(金币+3): 感谢参与 2011-08-27 10:42:41
引用回帖:
9楼: Originally posted by cexoihtydx at 2011-08-27 00:25:11:
分析：
1.TOP10菌株中的质粒应是高拷贝，质粒多。3ml菌液用于提取质粒即可。过夜摇菌时间不要超过12小时为宜，不然菌株老化，影响质粒提取。
2.最后一步加水洗脱，可加入50℃预热的无菌水30ul洗过柱子，也可少量 ...

对于1：如果接种量少，则需要摇较久，12小时不一定足够，我喜欢用OD1.5以上，提质粒没有问题。

对于2：“少量多次”这个做法在说明书上有，而且用的不是你说的水，而是用试剂盒提供的洗脱液。

对于5：假如要双酶切回收大片段质粒，我认为可以用100微升，因为可以使用特制梳子，长度与一般梳子一样，但是多个梳齿是并起来的一块，这样做出来的胶孔是一个长槽，可以跑超过100微升以上。这种梳子还有一个正常尺寸的梳齿，用于加DNA Ladder。
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11楼2011-08-27 02:43:43
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