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寂寞强强

铜虫 (正式写手)

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[求助] 提质粒遇到问题

今天用试剂盒提取质粒，结果上午提质粒后用3ul样品+1ulbuffer跑胶6组都能发现质粒，我们组的最清晰（第一张图的marker左边第二条带），下午酶切（大概2-2.5h）后把载体的酶切产物（100ul体系+20ul 6*buffer）跑胶结果都没有发现质粒的条带。大家说说是怎么回事呢？难道是Buffer加多了，还是酶切出问题了？

还有，昨天提质粒的时候，一格marker一格质粒，我们组跑胶时间比较长，质粒那条带在迁移过程中有一些不明显的条带在10000bp的地方有个模糊的条带，这个可能是什么？怎么会有这个东西

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Stayhungry，stayfoolish……

1楼 2011-08-26 20:02:15

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

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★ ★ ★
lstt09nk(金币+3): 感谢参与 2011-08-27 10:42:41

引用回帖:

9楼: Originally posted by cexoihtydx at 2011-08-27 00:25:11:
分析：
1.TOP10菌株中的质粒应是高拷贝，质粒多。3ml菌液用于提取质粒即可。过夜摇菌时间不要超过12小时为宜，不然菌株老化，影响质粒提取。
2.最后一步加水洗脱，可加入50℃预热的无菌水30ul洗过柱子，也可少量 ...

对于1：如果接种量少，则需要摇较久，12小时不一定足够，我喜欢用OD1.5以上，提质粒没有问题。

对于2：“少量多次”这个做法在说明书上有，而且用的不是你说的水，而是用试剂盒提供的洗脱液。

对于5：假如要双酶切回收大片段质粒，我认为可以用100微升，因为可以使用特制梳子，长度与一般梳子一样，但是多个梳齿是并起来的一块，这样做出来的胶孔是一个长槽，可以跑超过100微升以上。这种梳子还有一个正常尺寸的梳齿，用于加DNA Ladder。