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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 双酶切时间怎么确定
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苏拉的世界

金虫 (著名写手)

[交流] 双酶切时间怎么确定

我自己在Prok2的基础上构建的载体，用Xbal 1和BamH1双酶切，20ul的体系，要切多长时间比较合适呢，2个小时，还是三个小时？有做过的吗？指点一下
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1楼 2011-06-13 15:58:02
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
苏拉的世界(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-06-14 07:43:44
这两个酶的最适温度都是37℃，一般酶切2h足够了，如果两个酶最适酶切温度不一样的话一定要分开酶切
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2楼2011-06-13 16:12:24
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苏拉的世界

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-06-13 16:12:24:
这两个酶的最适温度都是37℃，一般酶切2h足够了，如果两个酶最适酶切温度不一样的话一定要分开酶切

俩酶一个是37度的，一个是30度的，用30度进行酶切的
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3楼2011-06-13 17:34:06
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
苏拉的世界(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+1): 是的，跟酶量也有关系啊 2011-06-14 07:45:31
跟底物也就是DNA的量还有关系的。
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4楼2011-06-13 20:26:11
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xuexue1204

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
苏拉的世界(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+2): 欢迎交流 2011-06-14 07:46:36
两个酶可以分开切的，你可以先同时切，切完跑胶看看，如果切不开的话，就分开切试试，一般不会有太大问题的
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5楼2011-06-13 20:46:24
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wutongyu77

铜虫 (初入文坛)
★
苏拉的世界(金币+1):谢谢参与
我觉得：加入的顺序很关键，先加水，再加buffer,然后质粒模板，最后加内切酶，酶切3小时，模板加的稍微多点，回收时每个点样孔加50微升，效果就很好了。
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6楼2011-06-15 10:58:23
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feng__

金虫 (著名写手)
★
苏拉的世界(金币+1):谢谢参与
分开i切吧
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7楼2011-06-15 11:11:54
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jia1012428

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
加试剂先后顺序没关系，只要混匀就行了，如果2个酶在通用缓冲液里的酶切效率都是100%，那2h就够了，不放心可以延长时间，不要超过4h。
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8楼2011-06-15 19:53:26
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great4591

银虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
酶切不用那么长时间，应该根据酶单位的定义来就行，一般37度一个小时就行，关键是订好模板量
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9楼2011-06-15 23:04:46
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qdwmq

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
与试剂的添加顺序无关，一般3h足够，NEB的Timesaver的话5min。
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10楼2011-06-15 23:23:11
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