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苏拉的世界

金虫 (著名写手)


[交流] 双酶切时间怎么确定

我自己在Prok2的基础上构建的载体,用Xbal 1和BamH1双酶切,20ul的体系,要切多长时间比较合适呢,2个小时,还是三个小时?有做过的吗?指点一下
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空谷幽风

金虫 (正式写手)


★ ★ ★
苏拉的世界(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-06-14 07:43:44
这两个酶的最适温度都是37℃,一般酶切2h足够了,如果两个酶最适酶切温度不一样的话一定要分开酶切
2楼2011-06-13 16:12:24
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苏拉的世界

金虫 (著名写手)


引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-06-13 16:12:24:
这两个酶的最适温度都是37℃,一般酶切2h足够了,如果两个酶最适酶切温度不一样的话一定要分开酶切

俩酶一个是37度的,一个是30度的,用30度进行酶切的
3楼2011-06-13 17:34:06
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★ ★
苏拉的世界(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+1): 是的,跟酶量也有关系啊 2011-06-14 07:45:31
跟底物也就是DNA的量还有关系的。
4楼2011-06-13 20:26:11
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xuexue1204

铜虫 (小有名气)


★ ★ ★
苏拉的世界(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+2): 欢迎交流 2011-06-14 07:46:36
两个酶可以分开切的,你可以先同时切,切完跑胶看看,如果切不开的话,就分开切试试,一般不会有太大问题的
5楼2011-06-13 20:46:24
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wutongyu77

铜虫 (初入文坛)



苏拉的世界(金币+1):谢谢参与
我觉得:加入的顺序很关键,先加水,再加buffer,然后质粒模板,最后加内切酶,酶切3小时,模板加的稍微多点,回收时每个点样孔加50微升,效果就很好了。
6楼2011-06-15 10:58:23
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feng__

金虫 (著名写手)



苏拉的世界(金币+1):谢谢参与
分开i切吧
7楼2011-06-15 11:11:54
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jia1012428

铜虫 (小有名气)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
加试剂先后顺序没关系,只要混匀就行了,如果2个酶在通用缓冲液里的酶切效率都是100%,那2h就够了,不放心可以延长时间,不要超过4h。
8楼2011-06-15 19:53:26
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great4591

银虫 (初入文坛)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
酶切不用那么长时间,应该根据酶单位的定义来就行,一般37度一个小时就行,关键是订好模板量
9楼2011-06-15 23:04:46
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qdwmq

木虫 (正式写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
与试剂的添加顺序无关,一般3h足够,NEB的Timesaver的话5min。
10楼2011-06-15 23:23:11
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