| 查看: 1886 | 回复: 5 | |||
[求助]
双酶切问题，跪求指导啊
|
各位大牛，谁来帮帮我啊，我最近做双酶切，目的片段500左右，连载pmd18-simple-t载体上，用的是NEB公司的not1和bamh1两个酶进行酶切，测序序列正确，可是not1就是切不动，not1我已经验证过了好用，什么单切，过夜切,都试过了，我用的是20ul体系酶各加0.5,单切10ul,20ul都用过了，。。。神了啊 ，这种情况我改怎么办啊 |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有139人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- Sac1和Xho1的双酶切连接
已经有5人回复
- 纠结的分子实验，双酶切连不上，求助
已经有14人回复
- 双酶切buffer加多了
已经有6人回复
- 关于双酶切后回收的问题
已经有12人回复
- PCR产物双酶切遇到问题，求救！！！
已经有7人回复
- 双酶切没有切开，怎么回事啊
已经有6人回复
- 关于XhoI和SacI双酶切的问题
已经有8人回复
- 双酶切后目的条带的疑问？
已经有8人回复
- 小片段双酶切求助，急急急
已经有18人回复
- 求助关于双酶切空载跑胶没有条带！
已经有15人回复
- 双酶切啥都没有？
已经有10人回复
- PET-32a双酶切无法回收
已经有8人回复
- 双酶切，切不下来
已经有19人回复
- 双酶切，体系，切不出来
已经有10人回复
- 求助 双酶切验证阳性克隆的问题
已经有12人回复
- 双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点
已经有52人回复
- 双酶切时间怎么确定
已经有9人回复
- 【求助/交流】关于双酶切
已经有6人回复
- 【求助/交流】相邻酶切位点的双酶切
已经有7人回复
- 【求助/交流】双酶切求助
已经有19人回复
- 【求助/交流】双酶切质粒后，目的条带浅且前方有模糊亮带
已经有12人回复
panda73
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 3
- 应助: 80 (初中生)
- 金币: 1201.3
- 散金: 44
- 红花: 2
- 帖子: 191
- 在线: 42.5小时
- 虫号: 985964
- 注册: 2010-03-30
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-08 17:22:10
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-08 17:22:10
|
你说得不是很清楚。我的理解是： 你已经将500bp的片段克隆至载体pmd-simple-t了，现在准备用NotI+BamHI将此500bp片段切下来（可能准备亚克隆？），问题出在双酶切上，对吧？ 如果上述推测正确，那么我建议你先对你的质粒DNA进行定量，然后各取1ugDNA,分别用NotI或BamHI进行单酶切，看看此两个酶切位点是否都能成功进行单切。（质粒成功进行单酶切后电泳的带型与未酶切的质粒不一样，电泳可以明显分辨）。 然后再考虑双酶切。 酶切时的两种酶的具体用量，我建议你利用double digestion designer(http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php)进行计算，不要随意估计，以确保完全酶切或者不会因酶量过多而出现酶的星活性。 |
2楼2013-10-08 16:55:27
sxxuan
金虫 (著名写手)
- MolEPI: 4
- 应助: 107 (高中生)
- 金币: 3442.4
- 散金: 104
- 红花: 17
- 帖子: 1478
- 在线: 266.1小时
- 虫号: 512865
- 注册: 2008-02-27
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
3楼2013-10-08 17:16:03
leonaliu2013
木虫 (著名写手)
- 应助: 27 (小学生)
- 金币: 1710.5
- 散金: 2850
- 红花: 4
- 帖子: 1527
- 在线: 83.1小时
- 虫号: 2601361
- 注册: 2013-08-14
- 专业: 微生物生理与生物化学
4楼2013-10-08 17:17:41
5楼2013-10-08 17:19:47
dang_qi
银虫 (小有名气)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 493.7
- 散金: 15
- 帖子: 53
- 在线: 46.1小时
- 虫号: 2371855
- 注册: 2013-03-23
- 性别: GG
- 专业: 生物信息学
6楼2013-10-08 17:22:21
5