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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Xho1和EcoR1双酶切，切不开
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牧歌ping

铜虫 (小有名气)

[求助] Xho1和EcoR1双酶切，切不开

我的目的片段是400bp左右，两端引入Xho1和EcoR1酶切位点，它们有共用的H buffer，双酶切怎么都切不开，单个酶切却都能切开；分别先一个酶切后乙醇沉淀，再另一个酶切，仍然切不开，很郁闷！
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1楼2012-11-06 11:21:55
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牧歌ping

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 475502411 at 2012-11-06 11:29:31
他们有公用的Buffer，但是在这个公用Buffer中的活性怎么样？如果活性太低的话要延长酶切时间的。
其实单酶切是可以的，不用醇沉，我经常做
你先用一个酶切，然后不要跑胶直接回收
然后再有另外一个酶切
都选他们 ...

两个酶的buffer都是H buffer，是它们活性最高的buffer。我每次至少做2管平行，一般酶切2~3h,最长切过夜了，可还是没有完全切开，感觉两个酶加一起有一个失活一样。如果不用醇沉，第二个酶切这个体系怎么弄啊？谢谢！
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5楼2012-11-06 15:15:57
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475502411

铜虫 (著名写手)
他们有公用的Buffer，但是在这个公用Buffer中的活性怎么样？如果活性太低的话要延长酶切时间的。
其实单酶切是可以的，不用醇沉，我经常做
你先用一个酶切，然后不要跑胶直接回收
然后再有另外一个酶切
都选他们活性最高的Buffer
第二个酶切后再跑胶回收
这样是不会有任何问题的应该就能切开了
但是要保证你的浓度，用第一个酶切的时候可以多做两管，用一个柱子回收，然后再用少量的洗脱液洗脱就好了、
祝你顺利
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
2楼2012-11-06 11:29:31
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jiangyinshen

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
牧歌ping: 金币+1, ★有帮助 2012-11-07 09:28:10
体系需要优化，酶切时间要延长，最好过夜，再做不出来的话就换试剂了
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不是風動，亦非幡動，仁者心動
3楼2012-11-06 12:02:44
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
牧歌ping: 金币+2 2012-11-07 09:28:02
楼主的目的片段怎么得来的？PCR然后胶回收吗？如果是胶回收的话，胶回收过程的乙醇对酶切影响很大，乙醇一定要挥发干。。。
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keepon
4楼2012-11-06 14:02:30
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