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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我用sal Ⅰ和xho Ⅰ双酶切链接目的基因，菌落pcr能p出目的条带，但酶切切不开。
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blueghost2

新虫 (小有名气)

[求助] 我用sal Ⅰ和xho Ⅰ双酶切链接目的基因，菌落pcr能p出目的条带，但酶切切不开。

后来知道这两个酶是同尾酶，目的片段连反了。怎么办啊，求指教！！！
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1楼2013-07-17 13:47:35
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回帖置顶 ( 共有3个 )

hanyuem

新虫 (初入文坛)
★ ★
gyesang: 回帖置顶 2013-07-18 14:19:09
gyesang: 金币+2, 正解！鼓励交流！ 2013-07-18 14:19:23
引用回帖:
4楼: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 15:41:26
对于你的挑选，建议用目的基因的引物进行菌体PCR验证，插反就是扩增质粒片段，插正确就是扩增目的基因片段。因为都在同一个载体环上嘛。...

这就说明您的片段连接上了而且是连反了，因为同尾酶的原因，所以切不下来
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8楼2013-07-17 18:42:19
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
blueghost2(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-18 14:20:47
gyesang: 回帖置顶 2013-07-18 14:21:04
切不开就对了，同尾酶切过之后，再连接，酶切位点就变了，再用原来的酶，肯定切不开了。所以你做的是对的。用M13引物P一下试试，看连接的怎么样？还有用35s启动子引物P试试，如果都正确，借往下面做。如果连接不正确，重新挑。不用酶切验证，这两个酶比较特殊。
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17楼2013-07-18 11:38:22
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zyllucky

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
blueghost2(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-18 14:20:57
gyesang: 回帖置顶 2013-07-18 14:21:06
多挑些克隆质粒小提，然后小量酶切筛选，能切的是对的，不能切的是错的。不过要还是用这两个酶切下来的话，你往其它质粒连还是有同样问题啊。两手准备吧，边筛边设计引物换酶切位点重新做
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糊涂仙儿
18楼2013-07-18 12:16:42
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普通回帖

huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
blueghost2: 金币+2 2013-07-17 15:29:25
两个建议，1，换酶切位点，2 ，多挑一些克隆子，验证，运气好也可以挑到正确的
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2楼2013-07-17 14:29:29
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blueghost2

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 14:29:29
两个建议，1，换酶切位点，2 ，多挑一些克隆子，验证，运气好也可以挑到正确的

换酶切位点太麻烦还得重新设计引物。我目前一直在挑斑，希望运气好一点。。
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3楼2013-07-17 15:29:17
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huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by blueghost2 at 2013-07-17 15:29:17
换酶切位点太麻烦还得重新设计引物。我目前一直在挑斑，希望运气好一点。。...

对于你的挑选，建议用目的基因的引物进行菌体PCR验证，插反就是扩增质粒片段，插正确就是扩增目的基因片段。因为都在同一个载体环上嘛。
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4楼2013-07-17 15:41:26
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blueghost2

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 15:41:26
对于你的挑选，建议用目的基因的引物进行菌体PCR验证，插反就是扩增质粒片段，插正确就是扩增目的基因片段。因为都在同一个载体环上嘛。...

我不是说了吗，菌落pcr能p出我的目的条带，但酶切验证却切不出我的目的片段
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5楼2013-07-17 17:23:33
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huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
blueghost2: 金币+2 2013-07-17 20:38:42
那你有没有测序看看呀，序列对不对，酶切位点对不对。如果是P得出，测序序列方向正确，没有移码，那也OK了。
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6楼2013-07-17 17:33:00
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hanyuem

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 14:29:29
两个建议，1，换酶切位点，2 ，多挑一些克隆子，验证，运气好也可以挑到正确的

个人觉得楼主最好一边重新换酶切位点，重新连，一边挑，两手准备
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7楼2013-07-17 18:40:48
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blueghost2

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by hanyuem at 2013-07-17 18:40:48
个人觉得楼主最好一边重新换酶切位点，重新连，一边挑，两手准备...

呵呵，做了三个月了，身心疲惫啊，还是重新设计引物吧
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9楼2013-07-17 20:36:00
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blueghost2

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by hanyuem at 2013-07-17 18:42:19
这就说明您的片段连接上了而且是连反了，因为同尾酶的原因，所以切不下来...

是的我知道已经连上了，但切不下来这是重点，因为同尾酶的缘故，酶切位点改变了
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10楼2013-07-17 20:37:50
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