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blueghost2

新虫 (小有名气)

[求助] 我用sal Ⅰ和xho Ⅰ双酶切链接目的基因,菌落pcr能p出目的条带,但酶切切不开。

后来知道这两个酶是同尾酶,目的片段连反了。怎么办啊,求指教!!!
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huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
blueghost2: 金币+2 2013-07-17 15:29:25
两个建议,1,换酶切位点,2 ,多挑一些克隆子,验证,运气好也可以挑到正确的
2楼2013-07-17 14:29:29
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blueghost2

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 14:29:29
两个建议,1,换酶切位点,2 ,多挑一些克隆子,验证,运气好也可以挑到正确的

换酶切位点太麻烦还得重新设计引物。我目前一直在挑斑,希望运气好一点。。
3楼2013-07-17 15:29:17
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huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by blueghost2 at 2013-07-17 15:29:17
换酶切位点太麻烦还得重新设计引物。我目前一直在挑斑,希望运气好一点。。...

对于你的挑选,建议用目的基因的引物进行菌体PCR验证,插反就是扩增质粒片段,插正确就是扩增目的基因片段。因为都在同一个载体环上嘛。
4楼2013-07-17 15:41:26
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blueghost2

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 15:41:26
对于你的挑选,建议用目的基因的引物进行菌体PCR验证,插反就是扩增质粒片段,插正确就是扩增目的基因片段。因为都在同一个载体环上嘛。...

我不是说了吗,菌落pcr能p出我的目的条带,但酶切验证却切不出我的目的片段
5楼2013-07-17 17:23:33
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huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
blueghost2: 金币+2 2013-07-17 20:38:42
那你有没有测序看看呀,序列对不对,酶切位点对不对。如果是P得出,测序序列方向正确,没有移码,那也OK了。
6楼2013-07-17 17:33:00
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hanyuem

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 14:29:29
两个建议,1,换酶切位点,2 ,多挑一些克隆子,验证,运气好也可以挑到正确的

个人觉得楼主最好一边重新换酶切位点,重新连,一边挑,两手准备
7楼2013-07-17 18:40:48
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hanyuem

新虫 (初入文坛)

★ ★
gyesang: 回帖置顶 2013-07-18 14:19:09
gyesang: 金币+2, 正解!鼓励交流! 2013-07-18 14:19:23
引用回帖:
4楼: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 15:41:26
对于你的挑选,建议用目的基因的引物进行菌体PCR验证,插反就是扩增质粒片段,插正确就是扩增目的基因片段。因为都在同一个载体环上嘛。...

这就说明您的片段连接上了而且是连反了,因为同尾酶的原因,所以切不下来
8楼2013-07-17 18:42:19
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blueghost2

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by hanyuem at 2013-07-17 18:40:48
个人觉得楼主最好一边重新换酶切位点,重新连,一边挑,两手准备...

呵呵,做了三个月了,身心疲惫啊,还是重新设计引物吧
9楼2013-07-17 20:36:00
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blueghost2

新虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by hanyuem at 2013-07-17 18:42:19
这就说明您的片段连接上了而且是连反了,因为同尾酶的原因,所以切不下来...

是的我知道已经连上了,但切不下来这是重点,因为同尾酶的缘故,酶切位点改变了
10楼2013-07-17 20:37:50
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