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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 目的基因连T载体能连上，双酶切后连不上HTB质粒，都三个月了，纠结啊。。。
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blueghost2

新虫 (小有名气)

[求助] 目的基因连T载体能连上，双酶切后连不上HTB质粒，都三个月了，纠结啊。。。

我的目的基因1450左右，HTB质粒4856bp，双酶切的酶sal Ⅰ,xho Ⅰ,
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1楼 2013-07-10 14:39:06
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

hanyuem

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
blueghost2: 金币+5, ★有帮助 2013-07-17 13:15:32
gyesang: 金币+2, 很有道理，载体都自连了！ 2013-07-17 14:34:47
SalI与XhoI是同尾酶，两个酶酶切后得到的粘性末端是一样的！！！所以这可能是你连不上的主要原因
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7楼2013-07-17 11:26:52
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yb19841014

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议你买个试剂盒做一下
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2楼2013-07-10 19:19:32
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yimeifang

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 分析的很好！ 2013-07-11 01:08:26
blueghost2: 金币+2, ★有帮助 2013-07-17 13:15:54
1.可能是目的基因片段太长了，导致连不上，可查阅此目的基因的相关资料，证实一下看是不是这个原因
2.可能是HTB质粒与目的基因不合适,可查阅HTB质粒的适用条件，再考虑要不要换连接质粒
3.可能是双酶切的酶有问题，可能是双酶切的两个酶切位点隔得很近，导致制切了一个位点，另一个没切成功，导致连不上；也可能是双酶切的缓冲液有问题，看它们所用缓冲液是否都适合两种酶酶切。
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3楼2013-07-10 20:25:34
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taojun

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励帮楼主分析问题！ 2013-07-11 01:08:42
blueghost2: 金币+2 2013-07-17 13:16:08
我觉得你的原因如下：
1、试剂盒有问题
2、你的连接体系有问题，你的比例是多大的，建议你换比例来连接，如1：8，1：10等
3、你的目的基因的条带亮度如何，够亮吗，你的载体条带亮度如何呢，最好要很亮
4、你酶切对了吗？如果对了的话，你就调整连接比例
建议你用TAKARA的连接试剂
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4楼2013-07-10 23:07:26
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jeneffer0601

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感觉是你的载体没有处理好，双酶切后应该做个自连，确定载体酶切干净后一般做连接都是没有问题的！
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5楼2013-07-15 16:06:11
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)
努力，我也是构建载体，现在的问题是切不开，你比我强
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Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
6楼2013-07-17 10:30:09
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blueghost2

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by hanyuem at 2013-07-17 11:26:52
SalI与XhoI是同尾酶，两个酶酶切后得到的粘性末端是一样的！！！所以这可能是你连不上的主要原因

粘性末端一样就连不上吗？请您解释一下
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8楼2013-07-17 12:55:25
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blueghost2

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xiaohaixie at 2013-07-17 10:30:09
努力，我也是构建载体，现在的问题是切不开，你比我强

9楼2013-07-17 12:55:45
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blueghost2

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yimeifang at 2013-07-10 20:25:34
1.可能是目的基因片段太长了，导致连不上，可查阅此目的基因的相关资料，证实一下看是不是这个原因
2.可能是HTB质粒与目的基因不合适,可查阅HTB质粒的适用条件，再考虑要不要换连接质粒
3.可能是双酶切的酶有问题 ...

目的片段不长，我们实验室目的片段3000左右都连上了。两酶切位点很远，两种酶的缓冲液都是Hbuffer
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10楼2013-07-17 12:58:16
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