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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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blueghost2

新虫 (小有名气)

[求助] 目的基因连T载体能连上,双酶切后连不上HTB质粒,都三个月了,纠结啊。。。

我的目的基因1450左右,HTB质粒4856bp,双酶切的酶sal Ⅰ,xho Ⅰ,
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hanyuem

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
blueghost2: 金币+5, 有帮助 2013-07-17 13:15:32
gyesang: 金币+2, 很有道理,载体都自连了! 2013-07-17 14:34:47
SalI与XhoI是同尾酶,两个酶酶切后得到的粘性末端是一样的!!!所以这可能是你连不上的主要原因
7楼2013-07-17 11:26:52
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普通回帖

yb19841014

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议你买个试剂盒做一下
2楼2013-07-10 19:19:32
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yimeifang

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 分析的很好! 2013-07-11 01:08:26
blueghost2: 金币+2, 有帮助 2013-07-17 13:15:54
1.可能是目的基因片段太长了,导致连不上,可查阅此目的基因的相关资料,证实一下看是不是这个原因
2.可能是HTB质粒与目的基因不合适,可查阅HTB质粒的适用条件,再考虑要不要换连接质粒
3.可能是双酶切的酶有问题,可能是双酶切的两个酶切位点隔得很近,导致制切了一个位点,另一个没切成功,导致连不上;也可能是双酶切的缓冲液有问题,看它们所用缓冲液是否都适合两种酶酶切。
3楼2013-07-10 20:25:34
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taojun

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励帮楼主分析问题! 2013-07-11 01:08:42
blueghost2: 金币+2 2013-07-17 13:16:08
我觉得你的原因如下:
1、试剂盒有问题
2、你的连接体系有问题,你的比例是多大的,建议你换比例来连接,如1:8,1:10等
3、你的目的基因的条带亮度如何,够亮吗,你的载体条带亮度如何呢,最好要很亮
4、你酶切对了吗?如果对了的话,你就调整连接比例
建议你用TAKARA的连接试剂
4楼2013-07-10 23:07:26
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jeneffer0601

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感觉是你的载体没有处理好,双酶切后应该做个自连,确定载体酶切干净后一般做连接都是没有问题的!
5楼2013-07-15 16:06:11
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)

努力,我也是构建载体,现在的问题是切不开,你比我强
Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
6楼2013-07-17 10:30:09
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blueghost2

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by hanyuem at 2013-07-17 11:26:52
SalI与XhoI是同尾酶,两个酶酶切后得到的粘性末端是一样的!!!所以这可能是你连不上的主要原因

粘性末端一样就连不上吗?请您解释一下
8楼2013-07-17 12:55:25
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blueghost2

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by xiaohaixie at 2013-07-17 10:30:09
努力,我也是构建载体,现在的问题是切不开,你比我强

9楼2013-07-17 12:55:45
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blueghost2

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by yimeifang at 2013-07-10 20:25:34
1.可能是目的基因片段太长了,导致连不上,可查阅此目的基因的相关资料,证实一下看是不是这个原因
2.可能是HTB质粒与目的基因不合适,可查阅HTB质粒的适用条件,再考虑要不要换连接质粒
3.可能是双酶切的酶有问题 ...

目的片段不长,我们实验室目的片段3000左右都连上了。两酶切位点很远,两种酶的缓冲液都是Hbuffer
10楼2013-07-17 12:58:16
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