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blueghost2

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by taojun at 2013-07-10 23:07:26
我觉得你的原因如下:
1、试剂盒有问题
2、你的连接体系有问题,你的比例是多大的,建议你换比例来连接,如1:8,1:10等
3、你的目的基因的条带亮度如何,够亮吗,你的载体条带亮度如何呢,最好要很亮
4、你酶 ...

我用的比例是1:3, 1:8  1:10是不是太大了?
11楼2013-07-17 12:59:19
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taojun

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by blueghost2 at 2013-07-17 12:59:19
我用的比例是1:3, 1:8  1:10是不是太大了?...

不大,你的条带亮度如何呢,能否看看呢
12楼2013-07-17 14:40:27
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hanyuem

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by xiaohaixie at 2013-07-17 10:30:09
努力,我也是构建载体,现在的问题是切不开,你比我强

我想问一下,你是怎么验证是否连接上的?
13楼2013-07-17 17:11:17
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额纪

木虫 (初入文坛)

最近也是在构建质粒,好像总是没连上,苦恼,祝你好运
活在当下,做好自己
14楼2013-07-17 17:14:04
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blueghost2

新虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by 额纪 at 2013-07-17 17:14:04
最近也是在构建质粒,好像总是没连上,苦恼,祝你好运

15楼2013-07-17 17:16:25
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blueghost2

新虫 (小有名气)

引用回帖:
13楼: Originally posted by hanyuem at 2013-07-17 17:11:17
我想问一下,你是怎么验证是否连接上的?...

菌落pcr 或酶切验证
16楼2013-07-17 17:16:50
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blueghost2

新虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by taojun at 2013-07-17 14:40:27
不大,你的条带亮度如何呢,能否看看呢...

你看下
目的基因连T载体能连上,双酶切后连不上HTB质粒,都三个月了,纠结啊。。。
7.11回收检验.jpg

17楼2013-07-17 17:21:13
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hanyuem

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

菌落PCR可能会有连上的,但是因为质粒自连容易,所以连上片段的会很少!你用切好的片段和载体,连上后因为是同尾酶,相同的粘性末端能够连上,但是切不下来!所以不管你怎么验证,都是阴性的
18楼2013-07-17 17:24:36
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

两个是同尾酶,不管你切的再好,载体自连的还是很多,所以你这种方法,很难得到阳性克隆,关于同尾酶,楼主最好查看资料。简单的说就相当于载体单酶切。因为两个酶切产生的粘性末端还是互补的。
如果你还是不想换酶,那就两个酶切了之后,用CIAP(碱性磷酸酶)处理一下酶切之后的载体,再做链接吧
19楼2013-07-17 23:28:59
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taojun

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
17楼: Originally posted by blueghost2 at 2013-07-17 17:21:13
你看下

7.11回收检验.jpg
...

难怪啊,你的条带太弱了啊,连不上太正常了啊,你多酶切几管啊,然后回收到一管里面啊,这样再去连接啊,我们平常连接的时候,条带一般都比最亮的MAKER还亮啊!
20楼2013-07-18 00:37:57
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