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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 目的基因连T载体能连上，双酶切后连不上HTB质粒，都三个月了，纠结啊。。。
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blueghost2

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by taojun at 2013-07-10 23:07:26
我觉得你的原因如下：
1、试剂盒有问题
2、你的连接体系有问题，你的比例是多大的，建议你换比例来连接，如1：8，1：10等
3、你的目的基因的条带亮度如何，够亮吗，你的载体条带亮度如何呢，最好要很亮
4、你酶 ...

我用的比例是1:3, 1:8  1:10是不是太大了？
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11楼2013-07-17 12:59:19
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taojun

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by blueghost2 at 2013-07-17 12:59:19
我用的比例是1:3, 1:8  1:10是不是太大了？...

不大，你的条带亮度如何呢，能否看看呢
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12楼2013-07-17 14:40:27
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hanyuem

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xiaohaixie at 2013-07-17 10:30:09
努力，我也是构建载体，现在的问题是切不开，你比我强

我想问一下，你是怎么验证是否连接上的？
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13楼2013-07-17 17:11:17
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额纪

木虫 (初入文坛)
最近也是在构建质粒，好像总是没连上，苦恼，祝你好运
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活在当下，做好自己
14楼2013-07-17 17:14:04
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blueghost2

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 额纪 at 2013-07-17 17:14:04
最近也是在构建质粒，好像总是没连上，苦恼，祝你好运

15楼2013-07-17 17:16:25
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blueghost2

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by hanyuem at 2013-07-17 17:11:17
我想问一下，你是怎么验证是否连接上的？...

菌落pcr 或酶切验证
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16楼2013-07-17 17:16:50
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blueghost2

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by taojun at 2013-07-17 14:40:27
不大，你的条带亮度如何呢，能否看看呢...

你看下
目的基因连T载体能连上，双酶切后连不上HTB质粒，都三个月了，纠结啊。。。
7.11回收检验.jpg
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17楼2013-07-17 17:21:13
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hanyuem

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

菌落PCR可能会有连上的，但是因为质粒自连容易，所以连上片段的会很少！你用切好的片段和载体，连上后因为是同尾酶，相同的粘性末端能够连上，但是切不下来！所以不管你怎么验证，都是阴性的
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18楼2013-07-17 17:24:36
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

两个是同尾酶，不管你切的再好，载体自连的还是很多，所以你这种方法，很难得到阳性克隆，关于同尾酶，楼主最好查看资料。简单的说就相当于载体单酶切。因为两个酶切产生的粘性末端还是互补的。
如果你还是不想换酶，那就两个酶切了之后，用CIAP（碱性磷酸酶）处理一下酶切之后的载体，再做链接吧
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19楼2013-07-17 23:28:59
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taojun

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
17楼: Originally posted by blueghost2 at 2013-07-17 17:21:13
你看下

7.11回收检验.jpg
...

难怪啊，你的条带太弱了啊，连不上太正常了啊，你多酶切几管啊，然后回收到一管里面啊，这样再去连接啊，我们平常连接的时候，条带一般都比最亮的MAKER还亮啊！
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20楼2013-07-18 00:37:57
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