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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 质粒提取 酶切 T载体与目的基因
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wei_suzhen

新虫 (小有名气)

[求助] 质粒提取 酶切 T载体与目的基因

用最近TaKaRa的pMD18-T Vector和目的基因（1257bp）连接,然后用氯化钙制备的大肠杆菌感受态细胞、然后转化，今天提质粒，电泳图如上，marker是5000bp。为什么条带不亮？在1500bp和2000bp出现条带是什么？在3000bp和5000bp出现的又是什么？
        另一个图是对提取的比较亮的质粒进行双酶切结果，为什么在1500bp和2000bp出现条带？在2000bp和3000bp的是什么带？
双酶切电泳图



质粒提取电泳图

[ Last edited by wei_suzhen on 2012-11-30 at 20:05 ]
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1楼 2012-11-30 19:33:42
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robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
scelab: 金币+3, 谢谢交流 2012-11-30 22:50:27
你的质粒提取液里没有加RNA酶吧，RNA太多，电泳时EB被结合，质粒自然不亮，也会影响酶切结果。
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2楼2012-11-30 21:49:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
scelab: 金币+4, 谢谢交流 2012-12-01 10:26:47
正如2L说的，RNA太多，最好消化一下再跑电泳做酶切。1500bp的是pMD18-T空载体超螺旋质粒，2000bp的是需要的阳性克隆超螺旋质粒，3000bp是载体开环质粒，5000bp是阳性克隆开环质粒。酶切反应不完全，效果不好，有没切开的质粒。
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3楼2012-12-01 08:33:13
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wei_suzhen

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by robert-RBT at 2012-11-30 21:49:10
你的质粒提取液里没有加RNA酶吧，RNA太多，电泳时EB被结合，质粒自然不亮，也会影响酶切结果。

嗯，没加RNA没加酶
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4楼2012-12-01 09:24:17
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wei_suzhen

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-01 08:33:13
正如2L说的，RNA太多，最好消化一下再跑电泳做酶切。1500bp的是pMD18-T空载体超螺旋质粒，2000bp的是需要的阳性克隆超螺旋质粒，3000bp是载体开环质粒，5000bp是阳性克隆开环质粒。酶切反应不完全，效果不好，有没切 ...

pMD18-T不是2692bp吗？质粒没切开，一般原因有哪些？
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5楼2012-12-01 09:28:01
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by wei_suzhen at 2012-12-01 09:28:01
pMD18-T不是2692bp吗？质粒没切开，一般原因有哪些？...

酶切效果不好可能是酶的问题，也可能是质粒质量不高，杂质多影响酶的活性。
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6楼2012-12-01 11:08:26
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