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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 最近做的菌落pcr，可以做胶回收吗？
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weining1203

新虫 (小有名气)

[求助] 最近做的菌落pcr，可以做胶回收吗？ 已有1人参与

如标题，最近跑的菌落pcr，1-3有拖尾和弥散，但是目的带很亮，产生这种现象的原因是什么啊，杂质比较多吗；4和5的模板是DNA，不是菌落，目的带比较弱，小弟想问一下1-3可不可做胶回收然后连T载体做克隆啊，还要优化pcr条件吗？

eric 2012-09-25 21hr 01min1.jpg
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1楼 2012-09-26 09:35:38
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
菌落PCR杂质多，不建议回收做克隆。做连用不了多少DNA的，回收多了也没用，一般50ul的PCR产物足以。
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weining1203
3楼2012-09-26 09:48:18
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普通回帖

wu_shiyong

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
菌液PCR这种情况正常，可以切胶回收后接着做克隆！
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低调稳重务实内敛---------------残
2楼2012-09-26 09:44:39
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weining1203

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-09-26 09:48:18
菌落PCR杂质多，不建议回收做克隆。做连用不了多少DNA的，回收多了也没用，一般50ul的PCR产物足以。

谢谢回复，您好楼上的说的相反，有点迷茫啊
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4楼2012-09-26 10:11:30
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以回收，连接，继续往下做的！
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weining1203
持之以恒、永不放弃！
5楼2012-09-26 10:17:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

内容已删除
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6楼2012-09-26 10:27:55
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-09-26 10:27:55
这个就看你了，反正我不从菌落PCR回收片段，一般只用于快速筛选。你都有菌了，不能先mini-prep再酶切或者PCR什么的吗？...

谢谢！现在重新设计了一条带酶切位点的引物做的pcr，让目的基因两边加上酶切位点，然后做原核表达！之前菌里面的目的基因没有酶切位点！请问mini-prep是什么，本人是新手，不懂啊，恳求指点
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7楼2012-09-26 10:32:46
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weining1203

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-09-26 10:17:11
可以回收，连接，继续往下做的！

谢谢啊
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8楼2012-09-26 10:33:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by weining1203 at 2012-09-26 10:32:46
谢谢！现在重新设计了一条带酶切位点的引物做的pcr，让目的基因两边加上酶切位点，然后做原核表达！之前菌里面的目的基因没有酶切位点！请问mini-prep是什么，本人是新手，不懂啊，恳求指点...

你的目的基因不在克隆载体里面吗？对不起我之前不知道。我以为你是用菌落PCR筛选阳性克隆。现在用引物引入酶切位点是比较常用的克隆方法。mini-prep是用试剂盒小规模纯化质粒。
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9楼2012-09-26 11:21:05
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-09-26 11:21:05
你的目的基因不在克隆载体里面吗？对不起我之前不知道。我以为你是用菌落PCR筛选阳性克隆。现在用引物引入酶切位点是比较常用的克隆方法。mini-prep是用试剂盒小规模纯化质粒。...

谢谢回复！目的基因在菌里面，不过基因两边没有引入酶切位点！现在用新设计的带有酶切位点的引物扩增原来的菌液，让目的基因两边加上酶切位点，用于进行下一步的双酶切
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10楼2012-09-26 12:02:12
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