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weining1203

新虫 (小有名气)

[求助] 最近做的菌落pcr,可以做胶回收吗? 已有1人参与

如标题,最近跑的菌落pcr,1-3有拖尾和弥散,但是目的带很亮,产生这种现象的原因是什么啊,杂质比较多吗;4和5的模板是DNA,不是菌落,目的带比较弱,小弟想问一下1-3可不可做胶回收然后连T载体做克隆啊,还要优化pcr条件吗?

eric 2012-09-25 21hr 01min1.jpg
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
菌落PCR杂质多,不建议回收做克隆。做连用不了多少DNA的,回收多了也没用,一般50ul的PCR产物足以。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

3楼2012-09-26 09:48:18
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普通回帖

wu_shiyong

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
菌液PCR这种情况正常,可以切胶回收后接着做克隆!
低调稳重务实内敛---------------残
2楼2012-09-26 09:44:39
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weining1203

新虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-09-26 09:48:18
菌落PCR杂质多,不建议回收做克隆。做连用不了多少DNA的,回收多了也没用,一般50ul的PCR产物足以。

谢谢回复,您好楼上的说的相反,有点迷茫啊
4楼2012-09-26 10:11:30
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可以回收,连接,继续往下做的!

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

持之以恒、永不放弃!
5楼2012-09-26 10:17:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

内容已删除
6楼2012-09-26 10:27:55
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weining1203

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-09-26 10:27:55
这个就看你了,反正我不从菌落PCR回收片段,一般只用于快速筛选。你都有菌了,不能先mini-prep再酶切或者PCR什么的吗?...

谢谢!现在重新设计了一条带酶切位点的引物做的pcr,让目的基因两边加上酶切位点,然后做原核表达!之前菌里面的目的基因没有酶切位点!请问mini-prep是什么,本人是新手,不懂啊,恳求指点
7楼2012-09-26 10:32:46
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weining1203

新虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-09-26 10:17:11
可以回收,连接,继续往下做的!

谢谢啊
8楼2012-09-26 10:33:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by weining1203 at 2012-09-26 10:32:46
谢谢!现在重新设计了一条带酶切位点的引物做的pcr,让目的基因两边加上酶切位点,然后做原核表达!之前菌里面的目的基因没有酶切位点!请问mini-prep是什么,本人是新手,不懂啊,恳求指点...

你的目的基因不在克隆载体里面吗?对不起我之前不知道。我以为你是用菌落PCR筛选阳性克隆。现在用引物引入酶切位点是比较常用的克隆方法。mini-prep是用试剂盒小规模纯化质粒。
9楼2012-09-26 11:21:05
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weining1203

新虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-09-26 11:21:05
你的目的基因不在克隆载体里面吗?对不起我之前不知道。我以为你是用菌落PCR筛选阳性克隆。现在用引物引入酶切位点是比较常用的克隆方法。mini-prep是用试剂盒小规模纯化质粒。...

谢谢回复!目的基因在菌里面,不过基因两边没有引入酶切位点!现在用新设计的带有酶切位点的引物扩增原来的菌液,让目的基因两边加上酶切位点,用于进行下一步的双酶切
10楼2012-09-26 12:02:12
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