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Nhe I和Hind III 双酶切pcDNA3.1(+)和目的片段2300bp，却连不上，求各位帮忙啊
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| 我用Nhe I和Hind III 双酶切pcDNA3.1(+)和目的片段2300bp，胶回收连接后挑菌提质粒跑电泳发现比原来空载的质粒还要小，而且单酶切后大小差不多，郁闷了很长时间，希望大家帮帮忙啊！！！！还有就是，谁有pcDNA3.1(+)的酶切位点图谱，可否发一下，急求啊！！！谢谢谢！！！ |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-03-03 21:36:04
yiyijiayou21: 金币+5, ★有帮助 2013-03-10 15:30:50
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酶切图谱http://tools.invitrogen.com/content/sfs/vectors/pcdna3.1-.pdf 从你的描述来看，可能是你的载体和外源片段酶切不完全（尤其是载体酶切不完全），导致大量的载体自连，所以都是空载体。 你用的这两个酶中，NheI所需的酶量比较多（因为各个酶的单位定义是不一样的）。我了保证酶切完全，我建议你用double digestion designer（进行双酶切设计，该软件可以精确计算酶切时所需要的酶量，保证完全酶切。我用此软件帮你算了一下，如果你酶切2ug pcDNA3.1，NdeI（NEB）需要35U，HindIII(NEB)只需要6U.如果你按照所谓的经验加酶量，则NheI肯定不够，导致NheI位点酶切不完全，最终导致载体自连。类似的，你可以用此软件计算完全酶切外源片段的酶量。祝好运。这个软件的链接如下：http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/showresult.php，可以免费试用。 |
2楼2013-03-03 20:03:21
3楼2013-03-10 15:25:30
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gyesang: 金币+2, 鼓励应助 2013-03-13 20:01:26
gyesang: 金币+2, 鼓励应助 2013-03-13 20:01:26
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首先，你需要明确：制备的质粒一般是三种状态的混合物，超螺旋DNA，线性DNA,环状但非超螺旋DNA。电泳时，超螺旋DNA电泳比较快，线性DNA位于中间（对照DNAmarker,其电泳位置应该与其理论大小一致），环状但非超螺旋DNA电泳最慢。 当你用质粒提取试剂盒制备质粒时（按照标准方法），电泳检测时，质粒应该主要是超螺旋DNA条带，在线性DNA位置为出现一条较弱的带，偶尔会出现环状但非超螺旋DNA。这就表明，制备的高质量的质粒DNA在电泳时，其主要条带位置应该在其理论分子量大小的前面（即看起来比理论分子量小）。但如果你用已知的一个酶进行单切后，再电泳时，就发现其电泳位置应该与其理论分子量一致（即线性DNA的位置）。 根据此特点，可以用酶切前后的电泳带型的变化来判断你的同一个DNA样品的单酶切是否完全。 具体做法是： 设计一组酶切实验：A:不酶切的DNA对照；B:酶1单酶切样品，C:酶2单酶切样品 酶切1-2小时后，同时进行电泳分析，根据电泳时的带型，就可以知道酶1和酶2是否酶切完全。酶切完全的样品其主要带的位置在线性DNA的位置，在超螺旋DNA的位置看不见或很淡。否则，如果在超螺旋DNA的位置出现很明显的条带，表明酶切不完全。酶切不完全的原因有以下几种可能：1；质粒的质量不是很好，存在一些变性的DNA，无法被酶切开，2.可能是你的酶保存不当，酶已经失活。3.你加的酶量不够，导致酶切不完全。你需要针对这些可能，再逐步排除。 希望对你有帮助 |
4楼2013-03-10 20:05:23
5楼2013-03-10 21:57:10
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【答案】应助回帖
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你各个电泳道上分别是什么？Marker的大小？ 问题： 1：你的质粒理论长度是多少？单酶切后显示的大小与预期一样吗？如果不一样，则需要考虑质粒是否弄错了。 2：你做的是哪一个酶的单酶切？建议也做一下另一个酶的单酶切，确保在你的酶切条件下，两个酶都正常工作（建议你用双酶切的buffer系统分别进行两种单酶切实验，以分析两种酶在双酶切条件下的是否正常）。 3：如果你未酶切的原始DNA电泳带在单切的DNA的电泳带的后面，意味着你提的质粒的质量不太好，主要为解开超螺旋的环状DNA分子（一般因为质粒制备过程中未按标准方法操作，导致超螺旋结构被破坏），但如果单酶切都可以正常线性化，一般不影响简单的克隆实验。 4建议你对DNA进行定量，然后电泳时尽量在每个电泳道上同样质量的DNA,以方便分析比较。 |
6楼2013-03-10 23:55:06
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Marker是λ-HindIII，条带从上到下大小是23130bp，9416bp， 6557bp， 4361bp，质粒载体的理论长度是5.5kb的，双酶切(NheI和HindIII)以后5.4kb和100bp，双酶切的两个酶的buffer是一样的，单酶切则是用的之前Bgl II做的酶切留下来的样品，上样顺序是单酶切，双酶切，原载体;提取质粒测的浓度时500ng/μl，260/280是1.88,260/230是2.3。应该还是可以的啊！！ 昨天重新的双酶切，50μl体系，NheI和HindIII 的用量分别是：3.5和2μl，过夜酶切八个小时左右，回收电泳时还好，但是胶回收以后再跑鉴定电泳，就依然是这样酶切前的质粒比酶切后的质粒大了！！ 第一张图是胶回收的，第一个是酶切前的质粒，第二个和第三个都是酶切后的（质粒的量不同）；第二张图是胶回收以后又跑的鉴定的电泳图，顺序和第一张图一样！  2013-3-11质粒酶切鉴定pcDNA(质粒，双酶切AB).jpg  2013-3-11质粒 酶切鉴定pcDNA(质粒，双酶切AB,c).jpg |
7楼2013-03-11 16:09:40
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