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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我用sal Ⅰ和xho Ⅰ双酶切链接目的基因，菌落pcr能p出目的条带，但酶切切不开。
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blueghost2

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 17:33:00
那你有没有测序看看呀，序列对不对，酶切位点对不对。如果是P得出，测序序列方向正确，没有移码，那也OK了。

酶切位点肯定不对要不然就切下来了
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11楼2013-07-17 20:38:35
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老伦敦把子肉

新虫 (初入文坛)

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★ ★
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blueghost2(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-18 00:42:23
可能是连反了 也可能出现突变了 不管怎么样 就算是最后分析出了结果也得重新来过 不如不要纠结啦 重新设计引物吧 加油
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12楼2013-07-17 20:55:26
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54808455

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-18 00:42:34
也许根本就没连进去，同尾酶，长出来的大多数是载体自连，菌落能PCR出来，是因为连接产物转化，涂到平板上，平板上有没有连接的目的基因。
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13楼2013-07-17 21:32:22
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guojing113

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-18 14:20:16
你连质粒的时候不可能只有一个酶切位点吧，为什么不拿旁边的酶切位点切一下？有的时候可能不单单是酶切的问题，还有可能是保护碱基没有设计好，导致酶切位点发生甲基化，使酶没有办法切开，这种也是有可能的。
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听雨
14楼2013-07-18 08:52:11
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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引物序列不用变 就把酶切位点换一下就OK了，酶切位点不影响PCR效果的。
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15楼2013-07-18 08:57:58
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

切不开就对了，同尾酶切过之后，再连接，酶切位点就变了，再用原来的酶，肯定切不开了。
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16楼2013-07-18 11:31:53
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
blueghost2(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-18 14:20:47
gyesang: 回帖置顶 2013-07-18 14:21:04
切不开就对了，同尾酶切过之后，再连接，酶切位点就变了，再用原来的酶，肯定切不开了。所以你做的是对的。用M13引物P一下试试，看连接的怎么样？还有用35s启动子引物P试试，如果都正确，借往下面做。如果连接不正确，重新挑。不用酶切验证，这两个酶比较特殊。
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17楼2013-07-18 11:38:22
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zyllucky

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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blueghost2(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-18 14:20:57
gyesang: 回帖置顶 2013-07-18 14:21:06
多挑些克隆质粒小提，然后小量酶切筛选，能切的是对的，不能切的是错的。不过要还是用这两个酶切下来的话，你往其它质粒连还是有同样问题啊。两手准备吧，边筛边设计引物换酶切位点重新做
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糊涂仙儿
18楼2013-07-18 12:16:42
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史前五百年

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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换酶切位点比较快，我就是这样干的。
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19楼2013-07-19 20:51:19
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