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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

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[求助] 用过pET28a(+)表达载体的高人请指教

本人合成了一段全基因序列，连接表达载体pET28a(+)，因为第一次做，错误的选择了EcoR1和Hind3作为酶切位点（红色标记），这样表达出的目的蛋白就会带有大量的载体氨基酸（蓝色框），影响活性。不知道哪位高人能够指点一些，该怎样处理才能保证蛋白活性？谢谢！！

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1楼2011-12-12 15:29:11

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月月大可

木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good! 2011-12-13 19:03:38

我一般使用Nde I酶切位点，这是能发挥his tag 功能又尽可能减少外援氨基酸的最优做法。但蛋白亲和层析阶段我还可以使用凝血酶将N段的his tag 切除。这样相当于同时进行了亲和层析纯化后再使用蛋白酶进行特异选择，一步下来即可获得极高纯度的目的蛋白。

看了楼主的回复，感觉是个外行人（我说话直）。
仅仅重新设计引物，更换酶切位点即可。不知道你在下游引入终止密码子没有，如果没有引入，这样目的蛋白就会在两端都带标签。
如果你根本不想用his tag，仅仅是用载体表达，你可以把上游酶切位点用Nco I。