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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 用过pET28a(+)表达载体的高人请指教
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 用过pET28a(+)表达载体的高人请指教

本人合成了一段全基因序列，连接表达载体pET28a(+)，因为第一次做，错误的选择了EcoR1和Hind3作为酶切位点（红色标记），这样表达出的目的蛋白就会带有大量的载体氨基酸（蓝色框），影响活性。不知道哪位高人能够指点一些，该怎样处理才能保证蛋白活性？谢谢！！
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1楼 2011-12-12 15:29:11
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

joan198108(金币+1): 2011-12-12 17:06:15
不用那么多钱吧，就是引物设计下，PCR下，就是内切酶贵点，不用很多钱吧。。
只要改一个5端用NcoI，其它可以不变
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8楼2011-12-12 16:35:59
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
joan198108(金币+2): 2011-12-12 16:29:40
重新构建吧，要除去这个貌似要酶切啥的
另外，一般这些tag对活性不会有非常大的影响？
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joan198108
2楼2011-12-12 16:15:36
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
joan198108(金币+2): 2011-12-12 16:31:04
先做了看看活性，没有活性的话重新构建，换酶切位点NcoI（也会多两个氨基酸），或者换载体。
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3楼2011-12-12 16:17:44
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海豚荣

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
joan198108(金币+2): 2011-12-12 16:33:09
28a可以构建C端和N端的蛋白融合，酶切位点我们一般都不会选hind3的
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乌托邦
4楼2011-12-12 16:27:08
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