24小时热门版块排行榜    

查看: 3332  |  回复: 5

wxl.1989822

金虫 (小有名气)

[求助] pET28a载体蛋白表达为包涵体

RT
本人最近在做利用pET28a载体表达纯化蛋白,菌是BL21,最近连续两次跑胶都是破碎后沉淀有目的条带,上清非常淡条带。具体实验步骤也就是:诱导后菌体4度离心后破碎,不过破碎后我采用的是常温离心10分钟左右,会不会是因为这样引起的蛋白被沉淀了?注:诱导采用的是终浓度0.2 0.4 0.6 0.8 1.0的梯度。诱导温度25和37结果差不多。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

质粒构建

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
wxl.1989822: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-13 10:38:09
可以试试IPTG浓度低一点,诱导温度16度过夜。此外,破碎后要低温离心,为什么要常温离心?常温离心也不一定会造成蛋白沉淀,但是如果蛋白不稳定的话,会有降解等风险。如果实在不可溶的话,要么尝试包涵体复性,要么换载体和宿主菌。可以采用BL21 TrxB菌,同时载体可以换成带GST标签或Trx标签等有促溶作用的。
2楼2013-03-13 09:42:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wxl.1989822

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-03-13 09:42:16
可以试试IPTG浓度低一点,诱导温度16度过夜。此外,破碎后要低温离心,为什么要常温离心?常温离心也不一定会造成蛋白沉淀,但是如果蛋白不稳定的话,会有降解等风险。如果实在不可溶的话,要么尝试包涵体复性,要么 ...

请问你用过BL21 TrxB菌吗?另外我们组其他人用的pET28a和BL21(DE3)的也没有出现过包涵体,我昨天又用16过夜诱导了,还是上清没有目的蛋白,而且沉淀里的量比37度的好像还低了点。
3楼2013-03-16 11:30:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

searchman

新虫 (初入文坛)

试试ArcticExpress Competent Cells,我用的载体和你一样,蛋白可溶性很好。
http://www.chem-agilent.com/pdf/strata/230191.pdf
4楼2013-03-18 01:51:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

appletree-

新虫 (小有名气)

有以下几种方法可以尝试:
1.降低温度,我用过18度,可以是有些包涵体转化为可溶性蛋白。
2.降低IPTG浓度,可降至0.01mM,设置梯度。
3.换用不同的载体
4.用分子伴侣
5楼2013-05-18 11:41:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

韩叽哩咕噜

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by searchman at 2013-03-18 01:51:43
试试ArcticExpress Competent Cells,我用的载体和你一样,蛋白可溶性很好。
http://www.chem-agilent.com/pdf/strata/230191.pdf

请问  是哪家的感受态呀?
6楼2018-10-31 16:25:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 wxl.1989822 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 今天系统多次维护,明天很可能放榜! +5 zju2000 2026-08-16 5/250 2026-08-16 23:23 by Haru815
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +32 医学老男孩 2026-08-13 74/3700 2026-08-16 21:05 by 医学老男孩
[论文投稿] 岩土工程学报什么时候才能终审完呐 25+3 yeager111 2026-08-10 4/200 2026-08-16 20:42 by tfang
[基金申请] 快农历七夕节了,轻松一下,男人悄悄话,女施主请不要进来。 +3 Tide man 2026-08-14 3/150 2026-08-16 17:47 by jurkat.1640
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 26/1300 2026-08-16 12:35 by 启萌科技
[基金申请] 我的国基提前知道中了,可是同事的操作让我实在接受不了,怎么会有这样的人 +11 家与远方 2026-08-10 16/800 2026-08-16 10:28 by ray43
[精细化工] 招聘 金属平磨液,抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +6 wangze12014 2026-08-14 7/350 2026-08-15 20:12 by gltch
[基金申请] filecode +8 cratir 2026-08-14 12/600 2026-08-15 18:08 by zyfgau
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的,真有人买论文么?感觉没必要啊 +12 Tide man 2026-08-10 13/650 2026-08-15 16:34 by 氺木
[基金申请] 各位道友,我要去昆明玩几天,回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] 奇怪,两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +8 布布和一二 2026-08-10 11/550 2026-08-14 14:58 by Equinoxhua
[硕博家园] 读博的好处 +4 lnee 2026-08-11 4/200 2026-08-14 10:20 by ahsoarli
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] FileCode能看出啥? +10 要乐观耀哥 2026-08-10 32/1600 2026-08-14 09:37 by 要乐观耀哥
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见,大家看看几个A,几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 帮忙看看fileCode +7 wwncly 2026-08-10 13/650 2026-08-11 19:36 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 什么时候出结果,有咨询渠道??? +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
信息提示
请填处理意见