应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pET28a载体蛋白表达为包涵体
61/1返回列表
查看: 3331  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

wxl.1989822

金虫 (小有名气)

[求助] pET28a载体蛋白表达为包涵体

RT
本人最近在做利用pET28a载体表达纯化蛋白，菌是BL21，最近连续两次跑胶都是破碎后沉淀有目的条带，上清非常淡条带。具体实验步骤也就是：诱导后菌体4度离心后破碎，不过破碎后我采用的是常温离心10分钟左右，会不会是因为这样引起的蛋白被沉淀了？注：诱导采用的是终浓度0.2 0.4 0.6 0.8 1.0的梯度。诱导温度25和37结果差不多。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

质粒构建

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-03-13 08:52:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wxl.1989822: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-13 10:38:09
可以试试IPTG浓度低一点，诱导温度16度过夜。此外，破碎后要低温离心，为什么要常温离心？常温离心也不一定会造成蛋白沉淀，但是如果蛋白不稳定的话，会有降解等风险。如果实在不可溶的话，要么尝试包涵体复性，要么换载体和宿主菌。可以采用BL21 TrxB菌，同时载体可以换成带GST标签或Trx标签等有促溶作用的。
赞一下 回复此楼
2楼2013-03-13 09:42:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wxl.1989822

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-03-13 09:42:16
可以试试IPTG浓度低一点，诱导温度16度过夜。此外，破碎后要低温离心，为什么要常温离心？常温离心也不一定会造成蛋白沉淀，但是如果蛋白不稳定的话，会有降解等风险。如果实在不可溶的话，要么尝试包涵体复性，要么 ...

请问你用过BL21 TrxB菌吗？另外我们组其他人用的pET28a和BL21（DE3）的也没有出现过包涵体，我昨天又用16过夜诱导了，还是上清没有目的蛋白，而且沉淀里的量比37度的好像还低了点。
赞一下 回复此楼
3楼2013-03-16 11:30:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

searchman

新虫 (初入文坛)
试试ArcticExpress Competent Cells，我用的载体和你一样，蛋白可溶性很好。
http://www.chem-agilent.com/pdf/strata/230191.pdf
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2013-03-18 01:51:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

appletree-

新虫 (小有名气)
有以下几种方法可以尝试：
1.降低温度，我用过18度，可以是有些包涵体转化为可溶性蛋白。
2.降低IPTG浓度，可降至0.01mM，设置梯度。
3.换用不同的载体
4.用分子伴侣
赞一下 回复此楼
5楼2013-05-18 11:41:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

韩叽哩咕噜

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by searchman at 2013-03-18 01:51:43
试试ArcticExpress Competent Cells，我用的载体和你一样，蛋白可溶性很好。
http://www.chem-agilent.com/pdf/strata/230191.pdf

请问  是哪家的感受态呀？
赞一下 回复此楼
6楼2018-10-31 16:25:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 wxl.1989822 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +32 医学老男孩 2026-08-13 74/3700 2026-08-16 21:05 by 医学老男孩
[论文投稿] 岩土工程学报什么时候才能终审完呐 25+3 yeager111 2026-08-10 4/200 2026-08-16 20:42 by tfang
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +13 archvillain 2026-08-15 25/1250 2026-08-16 20:13 by zhaosm1982
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +3 Tide man 2026-08-14 3/150 2026-08-16 17:47 by jurkat.1640
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +9 Ldrop2023 2026-08-13 9/450 2026-08-16 13:24 by wukun_007
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 26/1300 2026-08-16 12:35 by 启萌科技
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +10 majunge000 2026-08-11 12/600 2026-08-16 08:18 by xli1984
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊 +12 Tide man 2026-08-10 13/650 2026-08-15 16:34 by 氺木
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +10 majunge000 2026-08-10 13/650 2026-08-15 12:26 by hanpeng972
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] FileCode能看出啥？ +10 要乐观耀哥 2026-08-10 32/1600 2026-08-14 09:37 by 要乐观耀哥
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭