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tutufei

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】组氨酸标记的蛋白表达活性问题

我的蛋白当没有组氨酸标记时的活性很好，而加上组氨酸标记后，活性稍减弱，纯化后的条带很粗且单一，但检测不到活性，我尝试了降低诱导温度，IPTG的量，效果都不理想，能不能帮我分析分析，该怎么优化呢
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1楼 2011-01-13 20:54:29
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xulanzzz

金虫 (著名写手)
★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 23:42:56
tutufei(金币+1): 谢谢 2011-01-21 21:59:47
可能是包涵体。。。电泳有带但是没有酶活的话，要不是蛋白失活，要不是形成的是包涵体，包涵体是没有活性的，改变处理条件或者试着进行包涵体复性。
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2楼2011-01-13 21:49:09
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tutufei

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by xulanzzz at 2011-01-13 21:49:09:
可能是包涵体。。。电泳有带但是没有酶活的话，要不是蛋白失活，要不是形成的是包涵体，包涵体是没有活性的，改变处理条件或者试着进行包涵体复性。

包涵体不是不可溶的吗，离心时会和沉淀在一起，我是按可溶性蛋白的纯化方法纯化的
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3楼2011-01-13 21:57:05
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★
rainwander(金币+2):解释的很到位，鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 23:43:29
没有活性可能存在两种原因：
1 his tag影响了活性，尝试切除his tag后再次测定酶活。如果目前载体上没有酶切位点可以更换至有酶切位点的载体（例如pET28a N段his tag可以使用thrombin切除his tag）。或者重新构建表达载体，自己引入酶切位点。

2 如果切除了标签还是没有活性那就是蛋白本身的问题了。有些真核蛋白即使上清表达也是没有正确折叠的，或者没有进行表达后修饰，没有生物活性。这种情况就比较杯具了。

[ Last edited by 月月大可 on 2011-1-13 at 22:11 ]
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4楼2011-01-13 22:08:33
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tutufei

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2011-01-13 22:08:33:
没有活性可能存在两种原因：
1 his tag影响了活性，尝试切除his tag后再次测定酶活。如果目前载体上没有酶切位点可以更换至有酶切位点的载体（例如pET28a N段his tag可以使用thrombin切除his tag）。或者重新构建 ...

粗酶的活性还是有的，就是比较弱，但纯化后检测不到活性，基因两端的酶切位点分别是XhoI，NdeI，蛋白的原始菌是原核的，同时做的有三个功能类似的基因，只有这一个有问题
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5楼2011-01-13 22:49:17
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rainwander

铁杆木虫 (知名作家)
★ ★
dhd997(金币+2):good 2011-01-14 10:07:00
tutufei(金币+1): 谢谢 2011-01-21 22:00:05
2楼说的包涵体，我觉得有可能，

你的粗酶活性比较弱，产生包涵体之后就会更弱了。

当然到底是不是由于包涵体的原因，还得确定。
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6楼2011-01-13 23:46:09
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darling1210

铜虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2):good 2011-01-14 10:07:14
tutufei(金币+1): 谢谢 2011-01-21 21:57:42
楼主是否用不加IPTG诱导的，或者空白载体做对照呢，会不会你表达宿主本身可以表达你所检测酶活方法的那种酶呢？
要不然，如果你确定，你所纯化的单一条带是你的目标条带的话，怎么可能一点酶活也没有呢！
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7楼2011-01-14 00:33:48
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★
dhd997(金币+2):good 2011-01-14 10:07:25
tutufei(金币+5): 多谢你的建议 2011-01-21 22:00:42
楼上说的值得一试。

我认为不可能是包涵体。 楼主都挂在柱子上洗下来了，怎么还能是包涵体。

楼主又怎么知道是his tag引起的？  你标题给人传达的意思就是his tag 致使蛋白失活！

[ Last edited by 月月大可 on 2011-1-14 at 01:02 ]
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8楼2011-01-14 00:59:32
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流 2011-01-14 10:07:41
tutufei(金币+1): 谢谢，我试试 2011-01-21 21:58:33
可能是形成多聚体了。非还原胶跑下对照下分子量。
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9楼2011-01-14 07:53:52
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tutufei

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2011-01-14 00:59:32:
楼上说的值得一试。

我认为不可能是包涵体。 楼主都挂在柱子上洗下来了，怎么还能是包涵体。

楼主又怎么知道是his tag引起的？  你标题给人传达的意思就是his tag 致使蛋白失活！

[ Last edited by 月月 ...

我用不加his tag 的做过对照，相同的条件，活性相差比较大，所以我觉得是不是his tag对酶活有一定影响，但不是完全没有活性，就一直在优化诱导条件；不加IPTG的也做过对照，没有活性；序列也测了，没有问题。
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10楼2011-01-15 18:14:49
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月月大可

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by tutufei at 2011-01-15 18:14:49:

我用不加his tag 的做过对照，相同的条件，活性相差比较大，所以我觉得是不是his tag对酶活有一定影响，但不是完全没有活性，就一直在优化诱导条件；不加IPTG的也做过对照，没有活性；序列也测了，没有问题。

那就加入酶切位点，切除his tag吧。或者把his tag 换到C端。
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11楼2011-01-15 22:55:58
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zozozhonghe

新虫 (初入文坛)
★ ★
dhd997(金币+2): 欢迎继续多交流 2011-01-18 09:06:31
tutufei(金币+1): 谢谢 2011-01-21 21:59:27
可能his-tag 改变了酶的结构，对酶活有影响，在N端和C端连HIS-TAG的酶活一样吗？可
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12楼2011-01-17 23:10:58
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darling1210

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by darling1210 at 2011-01-14 00:33:48:
楼主是否用不加IPTG诱导的，或者空白载体做对照呢，会不会你表达宿主本身可以表达你所检测酶活方法的那种酶呢？
要不然，如果你确定，你所纯化的单一条带是你的目标条带的话，怎么可能一点酶活也没有呢！

求真相：LZ的问题解决了吗？
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13楼2011-01-22 10:55:54
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十比

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
换一个表达菌株试试吧。
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14楼2011-01-22 13:12:37
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mafangfang7131

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by tutufei at 2011-01-15 18:14:49:
我用不加his tag 的做过对照，相同的条件，活性相差比较大，所以我觉得是不是his tag对酶活有一定影响，但不是完全没有活性，就一直在优化诱导条件；不加IPTG的也做过对照，没有活性；序列也测了，没有问题。

楼主测的是什么酶的活性？用的具体体系和反应条件又是什么？
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15楼2012-01-04 14:47:28
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fangmi814

禁虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
16楼2012-02-28 19:59:36
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蝈蝈嗅

禁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
17楼2012-04-11 02:06:13
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樱花树下

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by fangmi814 at 2012-02-28 19:59:36
嗯，我也遇到同样的问题，蛋白是在上清中，也能过柱镍柱，就是纯化出来后没有活性，我现在在做超声条件的改变，想着是不是超声使蛋白的空间结构改变了从而影响了活性

请问最后是怎么解决的呀，超声对蛋白活性真的有影响吗
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18楼2015-11-24 15:48:12
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