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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】MBP融合蛋白活性低？
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】MBP融合蛋白活性低？ 已有5人参与

我在用MBP tag表达蛋白，亲和纯化后得到的融合蛋白，测定活性。发现活性很低，用factor Xa酶切，切完之后跑电泳发现有MBP，目的蛋白却不见了，是怎么回事？小弟都要愁死啦，实验做不出来没法毕业啊！敬请各位高人指点！
大家都是怎么做的？
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
1楼 2010-04-23 23:22:10
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
怎么无人理睬！？
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
2楼2010-04-24 09:12:10
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goodwish

木虫 (正式写手)

木虫书呆子
Anson1358(金币+6): 2010-04-24 17:51
使用MBP tag有一个问题，就是MBP表达效率太高，拖着后面的蛋白快速表达，而导致你的目的蛋白没有折叠好。
用蛋白酶切完后跑电泳，染胶的时候不要去掉浓缩胶，染完后注意看一下浓缩胶和分离胶之间是不是有一条带。如果有，那证明你的蛋白没有折叠好，切除前面的tag后聚集在一起形成大的复合体，跑不进分离胶。
如果出现这种情况，那你可以尝试在亲和纯化之后先过一个分子筛，看一下融合蛋白有没有聚集，把没有聚集的部分回收再用蛋白酶切。
如果依然聚集，那没办法了，换载体吧。
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生命的海洋里，我是蓝色的一滴
3楼2010-04-24 10:56:58
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
谢谢楼上的指点！要是低温诱导表达的话，会不会效果好一点?
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
4楼2010-04-25 10:27:05
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goodwish

木虫 (正式写手)

木虫书呆子
Anson1358(金币+4): 2010-04-27 20:46
引用回帖:
Originally posted by Anson1358 at 2010-04-25 10:27:05:
谢谢楼上的指点！要是低温诱导表达的话，会不会效果好一点?

个人认为效果不大。你可以尝试一下。降低温度，降低IPTG浓度，降低转速。再做一遍，如果不行建议尽早更换载体。
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生命的海洋里，我是蓝色的一滴
5楼2010-04-27 10:41:38
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
我把温度和转速降低啦！IPTG的浓度没有变！
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
6楼2010-04-27 20:47:45
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
现在还没有测活性，不知效果如何！
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
7楼2010-04-27 20:48:29
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阿娇阿娇

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜: 建议您单独发个帖子。在论坛版面的“MolEPI 牛人榜”下面，点击“撰写主题”的按钮就可以发帖了。 2012-03-10 14:49:11
你好，看到你几个月前发的贴子，有问题想请教一下。我现在也想把纯化过的MBP融合蛋白进行Xa因子蛋白酶酶切，请问一下你是放在4度切的吗？酶切完在过柱子之前先跑个胶？切完怎么把蛋白酶给除去啊？  我最关心的是最后一个问题
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

夏至1990
8楼2012-03-10 13:56:09
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joyva

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 阿娇阿娇 at 2012-03-10 13:56:09
你好，看到你几个月前发的贴子，有问题想请教一下。我现在也想把纯化过的MBP融合蛋白进行Xa因子蛋白酶酶切，请问一下你是放在4度切的吗？酶切完在过柱子之前先跑个胶？切完怎么把蛋白酶给除去啊？  我最关心的是最后 ...

蛋白酶有标签吧
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人生没有彩排，珍惜每一天！
9楼2014-01-26 23:30:01
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夏至1990

金虫 (小有名气)

小小虫
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
最后结果如何，方便加下我吗1016902450
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Sodoyouwanttotakealeapoffaith…orbecomeanoldman,filledwithregret…waitingtodiealone?
10楼2015-11-23 15:03:44
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