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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助！关于GST融合蛋白纯化！楼主愁得一夜没有睡好！
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

[求助] 求助！关于GST融合蛋白纯化！楼主愁得一夜没有睡好！

目前的情况是这样的：
1.构建的表达载体测序正确
2.37℃诱导有目的条带，表达量不错.
3.上清无目的蛋白，无酶活，这个与文献相符.
4.细胞破碎后，上清有目的蛋白，但是远不如沉淀物中目的蛋白含量高，另外感觉破碎怎么都不澄清，可能包涵体含量较高？
5.破碎后的细胞上清测量有酶活，且酶活力还不错.
6.目前用菌液量为1L，37℃诱导6h的细胞去破碎，之后测量酶活，发现只有上次破碎250ml细胞，单位酶活的1/3，可能是没有破碎完全？后取上清进行纯化，纯化后悲剧了……发现纯化后无酶活，目前正在进行SDS-PAGE，看流川液，洗涤液，洗脱液中是否有目的蛋白，楼主这个表达做了几个月了，好容易到了最后一步纯化了，昨晚12点测完酶活，心都是凉的……一宿没睡好.
想请大家帮忙分析一下，可能哪里出问题了.
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1楼 2012-09-19 09:23:36
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Marado: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-09-19 10:40:28
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励应助 2012-09-19 15:05:42
首先我觉得你的表达没有大的问题。如果觉得包涵体过多，可以考虑降低温度，30°或者16°，同时降低IPTG的浓度，。在高水平表达时,新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白折叠的速率就会导致包涵体的形成。因此,降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。
再有你的蛋白的酶活性，两次的破碎后未纯化的结果不同，这一步可能是超声的原因，因为两次的量不同，不知道你是怎么处理的？有些人认为超声功率过大会导致部分肽键断裂，不过没有被证实；总之，超声的条件是很重要的。
最后纯化的话：选择低盐浓度洗脱，一般蛋白纯化后都要除盐，在这你的蛋白虽然表达出来了，但是不代表就一定正确的折叠，这样就和包涵体一样，没有活性，你就得考虑变性再复性了，但是一般的结果不会太好。
你不是有文献吗？测酶活的时候照着文献来就是了。
最后，大肠表达系统的缺点就是可能表达的外源蛋白是没有活性的，因为大肠杆菌不会对目标蛋白进行正确修饰。而芽孢杆菌表达系统就克服了这个缺点，但是芽孢杆菌不好转化。
希望对你有用。
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coasttocoast。
5楼2012-09-19 10:25:02
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yubin0815

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-19 15:05:52
不知道你电泳的结果怎么样了
先是看有没有纯化到目的蛋白，再就是看看纯化体系是否影响酶活
大量诱导的单位表达量与预表达相比下降是正常的 可以优化条件或者扩大体积
总之 没必要太伤心 有表达有活性都是好事 说明已经成功了大半了

另外，洗脱体积大不大？纯化后是否进行了浓缩？
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Marado
2楼2012-09-19 10:06:47
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer
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引用回帖:
2楼: Originally posted by yubin0815 at 2012-09-19 10:06:47
不知道你电泳的结果怎么样了
先是看有没有纯化到目的蛋白，再就是看看纯化体系是否影响酶活
大量诱导的单位表达量与预表达相比下降是正常的 可以优化条件或者扩大体积
总之 没必要太伤心 有表达有活性都是好事 说 ...

刚才测了一下流川液的活性，有酶活，洗涤液没有酶活，可能是没有挂上柱子.
洗脱体积，是分了3次洗脱，每次4ml，纯化后没有进行浓缩.
PAGE还在进行中，如果是没有挂上柱子，可能的原因是什么呢，没有GST标签？我目的蛋白大小为65kDa，GST26kDa，PAGE跑出来表达量最大的条带是90+，应该带上了GST的，况且酶活测量也说明表达了，测序也是正确的.
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3楼2012-09-19 10:12:47
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gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Marado: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-09-19 10:40:37
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-19 15:06:05
引用回帖:
3楼: Originally posted by Marado at 2012-09-19 10:12:47
刚才测了一下流川液的活性，有酶活，洗涤液没有酶活，可能是没有挂上柱子.
洗脱体积，是分了3次洗脱，每次4ml，纯化后没有进行浓缩.
PAGE还在进行中，如果是没有挂上柱子，可能的原因是什么呢，没有GST标签？我目 ...

GST标签的蛋白一般挂柱效果都比较差。而且你是在37度诱导的，细菌生长最为迅速，产生蛋白也很快，所以蛋白的折叠会比较匆忙，很有可能你的蛋白没有正确折叠，把GST标签裹在里面了，所以才会不挂柱的。
所以介意你采取低温过夜诱导，尽量让蛋白正确缓慢的折叠，这样会对你的挂柱有所改善。
还有次级选择就是用尿素变性，这样GST标签就露在外面，就肯定能够挂柱了，不过变性复性的就会很麻烦，损失较大，活性也不见得会好。
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Marado
4楼2012-09-19 10:24:35
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer
引用回帖:
5楼: Originally posted by tupac225 at 2012-09-19 10:25:02
首先我觉得你的表达没有大的问题。如果觉得包涵体过多，可以考虑降低温度，30°或者16°，同时降低IPTG的浓度，。在高水平表达时,新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白折叠的速率就会导致包涵体的形成。因此,降低重组蛋白 ...

谢谢你，这个有一个问题，我蛋白表达出来了，而且测了确实有酶活，这可不可以说明折叠正确有活性呢？
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6楼2012-09-19 10:39:34
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer
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引用回帖:
4楼: Originally posted by gelois at 2012-09-19 10:24:35
GST标签的蛋白一般挂柱效果都比较差。而且你是在37度诱导的，细菌生长最为迅速，产生蛋白也很快，所以蛋白的折叠会比较匆忙，很有可能你的蛋白没有正确折叠，把GST标签裹在里面了，所以才会不挂柱的。
所以介意你 ...

没有正确折叠的话，蛋白会有活性？我测量了粗酶液有活性，而且还不错.
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7楼2012-09-19 10:40:14
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer
引用回帖:
5楼: Originally posted by tupac225 at 2012-09-19 10:25:02
首先我觉得你的表达没有大的问题。如果觉得包涵体过多，可以考虑降低温度，30°或者16°，同时降低IPTG的浓度，。在高水平表达时,新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白折叠的速率就会导致包涵体的形成。因此,降低重组蛋白 ...

再个，超声波我两次用的机器不一样，也有可能是破碎不完全的原因，我破碎后一直都无法澄清，有白色的沉淀，这个是蛋白？包涵体过多的缘故会不会造成破碎后白色沉淀的形成？
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8楼2012-09-19 10:41:53
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zhaoxiaoming

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
"3.上清无目的蛋白，无酶活，这个与文献相符.
4.细胞破碎后，上清有目的蛋白"?
这个是什么情况，怎么破碎后就有酶活了?低温，低转速诱导蛋白会正确折叠率高，上清蛋白会高些 ；破碎后无法澄清，有白色的沉淀，是包涵体含量太高，应该不是破碎的问题，我们一般50%功率，破1s间隔3s，1h就可以了。
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9楼2012-09-19 11:07:23
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tupac225

金虫 (正式写手)
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8楼: Originally posted by Marado at 2012-09-19 10:41:53
再个，超声波我两次用的机器不一样，也有可能是破碎不完全的原因，我破碎后一直都无法澄清，有白色的沉淀，这个是蛋白？包涵体过多的缘故会不会造成破碎后白色沉淀的形成？...

破碎后一直都无法澄清，还是包涵体过多的原因，白色的沉淀里会有大量的蛋白。
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coasttocoast。
10楼2012-09-19 11:08:04
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