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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】蛋白纯化
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wdongdong

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】蛋白纯化 已有3人参与

我最近在做GST-PULL DOWN ，但纯化的HIS融合蛋白量太低，用的是NOVAGEN 的柱子，杂带到是没什么了，只是纯化的量都不到1mg/ml,所以没法往下做了，请问哪位高手做过，给点建议,HIS融合蛋白的纯化步骤如下：


   用的 buffer:
8 Binding Buffer （8×= 4M NaCl，160mM Tris-HCl，40mM imidazole，pH 7.9）
8×Wash Buffer （8×= 4M NaCl，480mM imidazole，160mM Tris-HCl，pH 7.9）
4×Elute Buffer （4×= 4M imidazole，2M NaCl，80mM Tris-HCl，pH 7.9）
4×Strip Buffer （4×= 2M NaCl，400mM EDTA，80mM Tris-HCl，pH 7.9）
8×Charge Buffer （8×= 400mM NiSO4）


   买的是预装柱子，所以直接纯化：
1、取下预装柱盖子，尽量吸出上方所有保存缓冲液，去掉柱下 Luer 锁紧套口。
2、10ml 1×结合缓冲液平衡树脂后让所有缓冲液尽量流尽。
注意：若未能完全去掉保存液和彻底平衡树脂，树脂的结合力会降低，也可能导致目的蛋白在纯化过程中及后续
的透析步骤中析出形成沉淀。
柱层析纯化目的蛋白
1、待结合缓冲液流干，进行上样（即适量已准备好的细菌裂解物）。
2、10ml 1×结合缓冲液洗柱。
3、10ml 1×漂洗缓冲液洗柱。
4、5ml 1×洗脱缓冲液洗脱结合蛋白。另外，也可使用5ml 1×剥离缓冲液将结合蛋白和 Ni2+同时从柱上洗脱下
来。若需要可分段收集洗脱组分（如每1ml 收集一管）。




哪位高手指教一下，谢谢
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1楼 2010-06-23 18:42:02
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zemin_fang

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
收集纯化的蛋白，浓缩一下蛋白浓度不就满足要求了？
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2楼2010-06-23 20:47:36
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-06-24 15:17:44
washing使用60mM的咪唑有点高了。这个不是固定值，蛋白结合力比较弱的话都被你给洗掉完了。
washing buffer的浓度最好进行探试，在蛋白获得量和蛋白的纯度中间取个均衡。有些时候可以选择大量低浓度的咪唑洗脱。
如果你不愿意降低washing buffer的浓度，那就大量摇菌吧，一次摇个4-8L的，换个大柱子，纯化完了使用超滤管浓缩。

[ Last edited by 月月大可 on 2010-6-24 at 14:43 ]
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3楼2010-06-24 14:41:33
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-06-27 11:37:20
不想修改纯化条件就可以将纯化的蛋白浓缩一下，再测定浓度使用。
如果是修改纯化条件，可以按照楼上的方法将washing buffer条件修改一下，也可以设定梯度的浓度，试探的找下哪个浓度最适合。
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52187644
4楼2010-06-27 11:33:10
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