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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【专题】蛋白新纯化思路探讨
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cgt713

银虫 (小有名气)

[交流] 【专题】蛋白新纯化思路探讨已有14人参与

蛋白新纯化思路探讨

思路：得到需要纯化的样品中所有杂蛋白的抗体，将这些抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上，然后再将需要纯化的样品过这个柱子，所有杂蛋白都结合在柱子上，目的蛋白穿透出来。

具体例子：原核表达蛋白纯化
1.        无目的基因的PET28a-BL21，菌体超声破碎后离心分上清和沉淀，将上清拿去免疫兔子，得到针对杂蛋白的抗体，将抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上，命名这根柱子为X。PET28a-目的蛋白1-BL21诱导表达后，菌体超声破碎后离心分上清和沉淀，将上清过X柱，所有杂蛋白跟相应抗体结合，目的蛋白1穿透出来，实现纯化。
2.        无目的基因的PET28a-BL21，菌体超声破碎后离心分上清和沉淀，将沉淀拿去免疫兔子，得到针对杂蛋白的抗体，将抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上，命名这根柱子为Y。PET28a-目的蛋白2-BL21诱导表达后，菌体超声破碎后离心分上清和沉淀，沉淀用尿素溶解，复性后过Y柱，所有杂蛋白跟相应抗体结合，目的蛋白2穿透出来，实现纯化。
问题肯定会有很多，我们课题组想尝试这样做一些，请大家给点建议，有哪些需要注意的地方，谢谢。
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1楼2010-09-15 15:43:19
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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scelab(金币+5):谢谢交流！:tiger06: 2010-09-15 23:37:00
三个字：不现实！

1、杂蛋白的量要远远大于目的蛋白的量，而一定体积填料的载量是有限的，超过载量了杂蛋白就跟着目的蛋白一起出来。

2、上清中很有可能有很多量比较低的蛋白，这些蛋白拿来做抗体不见得能实现明显的免疫效果而达到需要的效价。
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2楼2010-09-15 15:53:57
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cgt713

银虫 (小有名气)

谢谢

引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-09-15 15:53:57:
三个字：不现实！

1、杂蛋白的量要远远大于目的蛋白的量，而一定体积填料的载量是有限的，超过载量了杂蛋白就跟着目的蛋白一起出来。

2、上清中很有可能有很多量比较低的蛋白，这些蛋白拿来做抗体不见得能实 ...

第一点我并不担心 可以通过控制上样量等来调整
第二点 我确实担心
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3楼2010-09-15 16:07:48
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
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scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-09-15 23:37:11
其实我觉得二楼说的很有道理。至于你所想的是否能够成为现实我不加评价，只能说你们有钱倒是可以玩玩！
从理论上来说菌体蛋白由很多种类，在偶联到纯化的过程中会出现不同程度的竞争或者有些蛋白就是偶联效率比较低的。你过柱子的时候是否一定能够保证纯度达到要求呢？如果无法将纯度保证到90%，那有为什么要用抗体株进行纯化呢？费时费力，不是么？
从实际经验来看，多种具有抗原表位的物质同时进入动物体内生产抗体的时候，并不是每一种蛋白都能够刺激产生抗体的，有些可能会有若反应或者无反应。你如何规避者部分不产生抗体的抗原反应呢？
以上至死个人建议。如果你能够做出来就和大家分享下里面的艰辛。
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52187644
4楼2010-09-15 19:03:15
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月月大可

木虫 (著名写手)
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引用回帖:
Originally posted by cgt713 at 2010-09-15 16:07:48:

第一点我并不担心 可以通过控制上样量等来调整
第二点 我确实担心

我看来第一点才是最关键的！！！

我们平常表达的蛋白总量相对于菌体总蛋白的含量甚至1%都不到，按照你的理论我们就需要将大于99%的杂蛋白挂在柱子上，1%的目的蛋白穿透！

这样来说我需要100mg的目的蛋白挂在柱子上的杂蛋白有10g！！！！！天哪，这是个什么概念，而现在我使用Ni柱对his标签的目的蛋白进行纯化，GE 的填料理论载量为20mg/ml,实际操作中我使用7ml左右就绰绰有余了。

如果你控制了上样量结果直接导致的便是极大的增加了工作量，或者增大了成本！
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5楼2010-09-16 10:10:35
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cgt713

银虫 (小有名气)

谢谢

引用回帖:
Originally posted by dianaofyezi at 2010-09-15 19:03:15:
其实我觉得二楼说的很有道理。至于你所想的是否能够成为现实我不加评价，只能说你们有钱倒是可以玩玩！
从理论上来说菌体蛋白由很多种类，在偶联到纯化的过程中会出现不同程度的竞争或者有些蛋白就是偶联效率比较 ...

谢谢你的意见 真的很不错 我也有想到这些 只是我现在想的是怎么尽量去提高效率
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6楼2010-09-16 14:06:24
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cgt713

银虫 (小有名气)

谢谢

引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-09-16 10:10:35:



我看来第一点才是最关键的！！！

我们平常表达的蛋白总量相对于菌体总蛋白的含量甚至1%都不到，按照你的理论我们就需要将大于99%的杂蛋白挂在柱子上，1%的目的蛋白穿透！

这样来说我需要100mg的目的蛋 ...

首先 我谢谢你的热心帮助 谢谢
但是目的蛋白的表达量只有1%，这是很难想象的 我们课题组一般平均下来都40%左右
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7楼2010-09-16 14:07:41
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jasco

木虫 (正式写手)
★
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dianaofyezi   和 月月大可的意见都是很中肯的，

不要纠结于月月大可说的表达量只有1%的情况，这里更重要的是提醒楼主纯化的载量和成本。实际上即使楼主做的重组蛋白表达量都在40%，要想用抗体柱子抓住60%的杂蛋白也是件很困难的事情。
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8楼2010-09-16 14:44:09
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月月大可

木虫 (著名写手)
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lstt09nk(金币+1):很有经验~ 2010-09-17 17:33:42
我说的1%一点都不算夸张，我身边的人全在做蛋白。以他们纯化的蛋白来看如果单次培养8L菌，纯度在95%目的蛋白能收获20-30mg就算是很不错了，能获得几百毫克的那是极少见（只针对可溶性上清，包涵体对我们的实验没有任何意义，我们的观点中包涵体复兴也基本是条投入大产出小的死路）。我目前做的蛋白属于表达量极大类型的，1L能获得的蛋白大约在50mg，很难想象收集菌体时候的一团一团的最后只能获得这一点，不过这就是显示。
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qqm8445
9楼2010-09-16 16:29:27
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jasco

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看到你写1%就估计到肯定是可溶表达了，能介绍下你们的研究么，因为还是有蛮多研究只需要包涵体就可以了
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10楼2010-09-16 16:59:42
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