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【专题】蛋白新纯化思路探讨 已有14人参与
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蛋白新纯化思路探讨 思路：得到需要纯化的样品中所有杂蛋白的抗体，将这些抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上，然后再将需要纯化的样品过这个柱子，所有杂蛋白都结合在柱子上，目的蛋白穿透出来。 具体例子：原核表达蛋白纯化 1. 无目的基因的PET28a-BL21，菌体超声破碎后离心分上清和沉淀，将上清拿去免疫兔子，得到针对杂蛋白的抗体，将抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上，命名这根柱子为X。PET28a-目的蛋白1-BL21诱导表达后，菌体超声破碎后离心分上清和沉淀，将上清过X柱，所有杂蛋白跟相应抗体结合，目的蛋白1穿透出来，实现纯化。 2. 无目的基因的PET28a-BL21，菌体超声破碎后离心分上清和沉淀，将沉淀拿去免疫兔子，得到针对杂蛋白的抗体，将抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上，命名这根柱子为Y。PET28a-目的蛋白2-BL21诱导表达后，菌体超声破碎后离心分上清和沉淀，沉淀用尿素溶解，复性后过Y柱，所有杂蛋白跟相应抗体结合，目的蛋白2穿透出来，实现纯化。 问题肯定会有很多，我们课题组想尝试这样做一些，请大家给点建议，有哪些需要注意的地方，谢谢。 |
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lstt09nk(金币+1):很有经验~ 2010-09-17 17:33:42
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lstt09nk(金币+1):很有经验~ 2010-09-17 17:33:42
| 我说的1%一点都不算夸张，我身边的人全在做蛋白。以他们纯化的蛋白来看如果单次培养8L菌，纯度在95%目的蛋白能收获20-30mg就算是很不错了，能获得几百毫克的那是极少见（只针对可溶性上清，包涵体对我们的实验没有任何意义，我们的观点中包涵体复兴也基本是条投入大产出小的死路）。我目前做的蛋白属于表达量极大类型的，1L能获得的蛋白大约在50mg，很难想象收集菌体时候的一团一团的最后只能获得这一点，不过这就是显示。 |
qqm84459楼2010-09-16 16:29:27
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scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-09-15 23:37:11
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scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-09-15 23:37:11
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其实我觉得二楼说的很有道理。至于你所想的是否能够成为现实我不加评价，只能说你们有钱倒是可以玩玩！ 从理论上来说菌体蛋白由很多种类，在偶联到纯化的过程中会出现不同程度的竞争或者有些蛋白就是偶联效率比较低的。你过柱子的时候是否一定能够保证纯度达到要求呢？如果无法将纯度保证到90%，那有为什么要用抗体株进行纯化呢？费时费力，不是么？ 从实际经验来看，多种具有抗原表位的物质同时进入动物体内生产抗体的时候，并不是每一种蛋白都能够刺激产生抗体的，有些可能会有若反应或者无反应。你如何规避者部分不产生抗体的抗原反应呢？ 以上至死个人建议。如果你能够做出来就和大家分享下里面的艰辛。 |
4楼2010-09-15 19:03:15
